高通量篩選環(huán)境雌激素類化合物的方法學(xué)研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是指由于人類的生產(chǎn)和生活活動釋放到環(huán)境中的、對人體內(nèi)和動物體內(nèi)內(nèi)源性的正常激素功能施加影響，從而影響機體內(nèi)分泌系統(tǒng)化學(xué)物質(zhì)作用的物質(zhì)，這類物質(zhì)通稱為“外源性干擾內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)”。環(huán)境雌激素是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物中最大的一類，也是研究最多，最受重視的一類。目前，檢測環(huán)境雌激素的方法主要有化學(xué)法和生物法。化學(xué)法檢測環(huán)境雌激素靈敏度高、特異度好，定性和定量準確。但是用儀器檢測環(huán)境雌激素，只能對已知的環(huán)境雌激素進行檢測，而且，在檢

2、測前一般還要對樣品要進行提取、凈化、濃縮等前期處理。由于這些化學(xué)方法使用的儀器昂貴、檢測成本高、分析過程冗長、技術(shù)復(fù)雜、對檢測人員專業(yè)化程度要求高，不適合大量樣本的環(huán)境雌激素常規(guī)檢測。建立在生物學(xué)基礎(chǔ)上檢測環(huán)境雌激素的方法大多需要進行細胞培養(yǎng)，對實驗室條件要求較高、費時費力，不同的實驗室使用的細胞不同，不便于結(jié)果的相互比較，培養(yǎng)細胞所用的血清也要經(jīng)過活性炭和葡聚糖處理，去除血清中內(nèi)源性的雌激素后才能使用，否則會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。有的環(huán)境

3、雌激素還具有細胞毒性，這樣有可能導(dǎo)致得出錯誤的結(jié)論。
　　 因此，根據(jù)大多數(shù)環(huán)境雌激素與機體作用都是干擾天然雌激素與雌激素受體結(jié)合，我們以雌激素受體競爭結(jié)合分析為基礎(chǔ)，建立以下三種方法來高通量的篩選環(huán)境雌激素。
　　 第一部分：基于ELISA的受體競爭結(jié)合法檢測環(huán)境雌激素
　　 目的：環(huán)境雌激素是最主要的一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，它們進入生物體后，可通過干擾生物體自身激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運、結(jié)合、活性反應(yīng)、代謝、消解

4、或產(chǎn)生類似生物體自身激素的作用，對生物有機體維護正常的動態(tài)平衡、繁殖、生長及行為產(chǎn)生不利的影響。本研究的目的旨在建立環(huán)境雌激素的體外快速篩選方法。
　　 方法：采用免疫測定介導(dǎo)受體競爭結(jié)合試驗定量檢測環(huán)境雌激素。將17β-雌二醇-BSA固定在微孔板上，環(huán)境雌激素與微孔板上的17β-雌二醇-BSA競爭性的與雌激素受體結(jié)合，與微孔板上17β-雌二醇-BSA結(jié)合的受體與雌激素受體的抗體、雌激素受體抗體的二抗形成一個三明治形式的復(fù)合物，

5、通過顯色劑顯色，最后用比色法對試驗結(jié)果進行定量。
　　 結(jié)果：整個反應(yīng)中環(huán)境雌激素濃度越高，溶液的吸光度值的變化就越小，環(huán)境雌激素的濃度與吸光度值成負相關(guān)。定量研究可以得到環(huán)境雌激素劑量－效應(yīng)關(guān)系曲線，在一定濃度范圍內(nèi)（10ng/L～100μg/L），溶液的吸光度值與環(huán)境雌激素的濃度直接呈現(xiàn)良好的線形關(guān)系（R2=0.9583）。利用這種方法能檢測到的標準品雌二醇的最低濃度為10ng/L。
　　 結(jié)論：本方法檢測環(huán)境雌激素

6、操作簡便、無需復(fù)雜昂貴的儀器，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 第二部分：熒光標記17β-雌二醇檢測環(huán)境雌激素
　　 目的：熒光標記這種非放射性標記技術(shù)已成為現(xiàn)代分析檢測中不可或缺的重要方法之一,然而將此技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境雌激素的篩選并不廣泛。本研究旨在探索熒光標記技術(shù)在環(huán)境雌激素定量檢測中的應(yīng)用。
　　 方法：首先將雌激素受體的抗體固定于微孔板中，將待測樣本或17β-雌二醇、與定量的17β-雌二醇-FITC、雌激素受體混

7、和后加入微孔板中，孵育后取上清（上清中含有因環(huán)境雌激素干擾而未能與雌激素受體結(jié)合的的17β-雌二醇-FITC），加入另一新的微孔板中，用酶標儀檢測溶液中熒光信號的強度。
　　 結(jié)果：溶液的熒光強度與環(huán)境雌激素的濃度呈正相關(guān)，在一定濃度范圍內(nèi)（10ng/L～100μg/L），溶液的熒光強度與環(huán)境雌激素濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.9793）。利用這種方法能夠檢測到的標準品17β-雌二醇的最低濃度為10 ng/L。
　

8、　 結(jié)論：本研究方法檢測環(huán)境雌激素靈敏度高，無需復(fù)雜昂貴的設(shè)備，試驗操作非常簡單，可在微孔板和芯片上進行，是一種高通量快速篩選環(huán)境雌激素的方法。
　　 第三部分：納米金顆粒修飾雌激素受體反應(yīng)原件檢測痕量環(huán)境雌激素的方法學(xué)研究
　　 目的：雌激素受體競爭結(jié)合分析試驗是重要的環(huán)境雌激素的篩選試驗，是美國EDSTAC首選的第一級環(huán)境內(nèi)分泌干擾物篩選試驗之一。本研究根據(jù)環(huán)境雌激素在機體內(nèi)發(fā)揮作用的基本機理，即環(huán)境雌激素進入機體

9、，結(jié)合并激活雌激素受體，進而使受雌激素受體控制的基因表達。本研究是利用納米金標記檢測技術(shù)介導(dǎo)雌激素受體競爭結(jié)合分析建立的一種環(huán)境雌激素高通量快速篩選方法。
　　 方法：首先將17β-雌二醇-BSA固定于微孔板中，將待測樣本與定量的雌激素受體混和后加入微孔板中，孵育后取上清（上清中含有因環(huán)境雌激素干擾而未能與微孔板上的17β-雌二醇結(jié)合的雌激素受體），將上清加入另一包被有雌激素受體抗體的的微孔板中，使雌激素受體與抗體結(jié)合，然后加入

10、標記有納米金的雌激素反應(yīng)元件探針，孵育一段時間，用銀染增強顯色檢測光密度。
　　 結(jié)果：在一定的反應(yīng)時間內(nèi)，溶液的吸光度值與環(huán)境雌激素的量呈正相關(guān)，定量研究可以得到在一定反應(yīng)時間點（銀染增強時間100～140秒）和一定濃度范圍內(nèi)（100pg/L～1μg/L），溶液的吸光度值與17β-雌二醇之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.9764）。利用這種方法能夠檢測到的標準品17β-雌二醇的最低濃度為100 pg/L。
　　 結(jié)論：