超聲波技術(shù)在豬脫鈣骨基質(zhì)制備中的應(yīng)用研究

1、超聲波輔助脫鈣技術(shù)用于豬脫鈣骨基質(zhì)制備的效果評(píng)價(jià)任智超，王欣，劉寶林(200093上海，上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院)［摘要］目的目的以豬后腿骨干骺端為對(duì)象，考察超聲波技術(shù)在脫鈣骨基質(zhì)制備過(guò)程中的作用。方法方法6月齡公豬后腿骨清洗切片，分別用傳統(tǒng)脫鈣制備法和超聲波輔助脫鈣制備法進(jìn)行脫鈣骨基質(zhì)的制備，超聲波功率：220W，頻率：25kHz。超聲波處理時(shí)間：0～6h。以脫鈣骨的脫鈣率考察超聲波對(duì)脫鈣效果的影響；利用MicroCT和顯微鏡觀

2、察脫鈣骨的大體三維結(jié)構(gòu)；測(cè)量其孔隙率和孔徑大?。焕梦镄詼y(cè)試儀測(cè)量脫鈣骨的壓縮模量以表征其力學(xué)性能。結(jié)果結(jié)果脫鈣骨脫鈣率的測(cè)量結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)脫鈣法相比，超聲波輔助脫鈣制備法僅需6h就可使脫鈣率達(dá)到100%，脫鈣時(shí)間可縮短45.5%；且制備的脫鈣骨具有良好的孔隙率和互相連通的孔徑結(jié)構(gòu)，孔隙率達(dá)到85%以上，孔徑大小為(348.1864.86)μm，與傳統(tǒng)制備方法無(wú)顯著差異；并具有良好的力學(xué)性能，在脫除90%以上的鈣后脫鈣骨的壓縮模量仍可

3、達(dá)到(6.420.83)Nmm2。結(jié)論結(jié)論超聲波輔助脫鈣技術(shù)可以有效提高脫鈣骨基質(zhì)的制備效率，且制備效果良好。［關(guān)鍵詞］豬、干骺端、超聲波、脫鈣骨［中圖法分類號(hào)］R318[文獻(xiàn)標(biāo)志碼文獻(xiàn)標(biāo)志碼]AApplicationofultrasoundaideddecalcifyingtechniquesinpreparationofdecalcifiedswinebonematrixRenZhichaoWangXinLiuBaolin(Coll

4、egeofMedicalInstrumentsFoodEngineeringShanghaiUniversityofScienceTechnologyShanghai200093China)［Abstract］ObjectiveToinvestigatetheroleofultrasoundaideddecalcifyingtechniquesinpreparationofdecalcifiedswinebonematrix.Metho

5、dsHindlegboneofmaleswineattheageof6monthswasleanedcutintosections.Decalcifiedswinebonematrixwaspreparedwiththetraditionalultrasoundaideddecalcifyingtechniquesrespectively.Theultrasoundpowerfrequencytimeusedinpreparationo

6、fdecalcifiedswinebonematrixwere220W25kHz06hrespectively.Effectofultrasoundaideddecalcifyingtechniqueonthedecalcificationrateofbonematrixwasobserved.Threedimensionalstructureofthedecalcifiedbonematrixwasobservedunderamicr

7、oscope.PositypesizeofthedecalcifiedbonematrixweremeasuredbymicroCT.Mechanicalpropertiesofthedecalcifiedbonematrixwereassayedexpressedasacompressmodulus.ResultsThedecalcificationrateofultrasoundaideddecalcifyingtechniquef

8、bonematrixcouldreach100%in6hwhichwassignificantlyhigherthanthatoftraditionaldecalcifyingtechnique.Thedecalcifyingtimeofultrasoundaideddecalcifyingtechniquefbonematrixcouldbeshtedby45.5%.Thepositypesizeofthedecalcifiedbon

9、ematrixwereover中吸取體積為V1的溶液分別置于3個(gè)錐形瓶中。再向3個(gè)錐形瓶中分別加入5%的三乙醇胺3ml，氨性緩沖溶液15ml，檸檬酸鈉3ml，鉻黑T指示劑5滴，然后用0.02molL的EDTA進(jìn)行滴定，當(dāng)錐形瓶中溶液的顏色由酒紅色變?yōu)榱了{(lán)色即為滴定終點(diǎn)，EDTA消耗的體積記為V0。脫鈣骨鈣含量計(jì)算公式如下：10sVXVm100??????????式中，X—脫鈣骨鈣含量，（mgg）V0—滴定鈣離子所消耗EDTA的體積的平均

10、值（3個(gè)樣品的平均值），(ml)T—EDTA的標(biāo)定的濃度，ms—樣品的質(zhì)量，（g）V1—所取樣液的體積（ml）脫鈣骨脫鈣率的計(jì)算公式如下：??00XXK100%X??式中，K—脫鈣骨脫鈣率，X0—不經(jīng)脫鈣處理樣品的鈣含量，（mgg）X—脫鈣處理后脫鈣骨的鈣含量，（mgg）1.3.2孔隙率采用Skyscan1074HR型MicroCT對(duì)脫鈣骨樣品進(jìn)行掃描，每轉(zhuǎn)動(dòng)3.6進(jìn)行掃描拍照，每個(gè)樣品掃描360。掃描后利用MicroCT的系統(tǒng)軟件對(duì)脫

11、鈣骨進(jìn)行三維重構(gòu)，再利用MicroCT的CTAN軟件對(duì)三維重構(gòu)后脫鈣骨的孔隙率進(jìn)行測(cè)量分析。1.3.3孔徑將脫鈣骨樣品進(jìn)行切片，厚度在0.5mm左右。置于載玻片上利用Nikon55i型顯微鏡進(jìn)行拍照，顯微鏡目鏡為10倍鏡，物鏡為4倍鏡。利用Digimizer3.1圖片分析軟件對(duì)孔徑大小進(jìn)行測(cè)量，隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域?qū)γ撯}骨孔徑大小進(jìn)行測(cè)量。1.3.4壓縮模量采用壓縮法，物性測(cè)試儀壓頭直徑2cm，壓縮速率為0.5mms。選取脫鈣骨中心部位，進(jìn)

12、行壓縮測(cè)量。單位Nmm2，以脫鈣骨彈性變形區(qū)的曲線的斜率表示其壓縮模量，此斜率即為應(yīng)力與應(yīng)變的比值。每種處理方式選3個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)量，最后取平均值。1.4數(shù)據(jù)分析方法應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用ANOVA進(jìn)行Duncan多重檢驗(yàn)分析，并用Excel軟件進(jìn)行圖形繪制。2結(jié)果與分析2.1脫鈣方法對(duì)脫鈣率的影響脫鈣骨的脫鈣率代表了脫鈣骨的脫鈣程度，是判斷脫鈣骨制備效果的一項(xiàng)重要指標(biāo)，當(dāng)脫鈣率達(dá)到100%時(shí)表示完全脫鈣。傳統(tǒng)制備法及

13、超聲波制備法對(duì)脫鈣率的影響如圖1所示。由圖1可見，隨脫鈣時(shí)間延長(zhǎng)，2種方法所制備的脫鈣骨的脫鈣率均不斷提高。在脫鈣的第1h，2種方法的脫鈣率上升明顯，超聲波制備法的脫鈣率為(92.050.51)%，傳統(tǒng)脫鈣法的脫鈣率為（78.570.89）%，從脫鈣效果來(lái)看超聲波制備法明顯好于傳統(tǒng)制備法，兩者呈顯著性差異（P＜0.05）。脫鈣1h后隨著脫鈣時(shí)間的延長(zhǎng)，脫鈣率緩慢提高，傳統(tǒng)制備法脫除樣品中100%的鈣所需的時(shí)間為11h，而超聲波波制備法僅

14、需6h就可完成此過(guò)程，脫鈣時(shí)間相對(duì)縮短了45.5%。020406080100120024681012脫鈣時(shí)間(h)脫鈣率(%)傳統(tǒng)制備法超聲波制備法圖1脫鈣方法對(duì)脫鈣骨的脫鈣率的影響2.2脫鈣方法對(duì)孔隙率的影響作為支架材料，脫鈣骨應(yīng)具有較高的孔隙率，以利于細(xì)胞和生長(zhǎng)因子在脫鈣骨支架內(nèi)均勻的分布及生長(zhǎng)[20]。本研究采用MicroCT對(duì)脫鈣骨進(jìn)行360二維掃描，之后利用MicroCT的系統(tǒng)軟件對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)行三維重構(gòu)分析，重構(gòu)出脫鈣骨的截面

15、圖。分析結(jié)果表明，超聲波法制備的脫鈣骨具備良好的三維網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，且孔隙間彼此相通。脫鈣骨作為支架材料孔隙率應(yīng)在75%以上，才能有利于細(xì)胞的黏附及細(xì)胞外基質(zhì)的生長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)關(guān)于脫鈣骨孔隙率的報(bào)道一般在80%以上[21]，本研究中，超聲波制備法制備的脫鈣骨，當(dāng)脫鈣率為100%時(shí)，脫鈣骨的孔隙率為(88.341.54)%，傳統(tǒng)方法制備的脫鈣骨，當(dāng)脫鈣率為100%時(shí)，脫鈣骨的孔隙率為(87.871.55)%，脫鈣的孔隙率2種方法所得到的