藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)四線粒體和細(xì)胞核的制備與觀察

1、二、實(shí)驗(yàn)原理　　線粒體是真核細(xì)胞特有的進(jìn)行能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器。將動(dòng)植物組織制成勻漿，在適當(dāng)?shù)膽腋〗橘|(zhì)中差速離心法可以分離細(xì)胞線粒體。在一定的離心場(chǎng)中（選用離心機(jī)的一定轉(zhuǎn)速），球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一均勻的懸浮介質(zhì)中離心一定時(shí)間，組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細(xì)胞器

2、沉降先后順序是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。,差速離心技術(shù)：利用細(xì)胞核與線粒體在一定介質(zhì)中的沉降速度的差異，可采取分級(jí)差速離心的方法，將細(xì)胞核與線粒體逐級(jí)分離出來(lái)。　　懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性；pH7.2的條件下，亞細(xì)胞組分不容易聚集成團(tuán)，有利于分離。整個(gè)操作過(guò)程樣品要保持在0℃-4℃，避免酶失活。,細(xì)胞器標(biāo)記酶的測(cè)定是評(píng)價(jià)細(xì)胞器內(nèi)膜組分和分

3、離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色，從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無(wú)色。,詹納斯綠B是一種活體染料，能對(duì)動(dòng)植物的細(xì)胞或組織在活體狀態(tài)下進(jìn)行無(wú)毒害的染色。由于染料（堿性染料）的膠粒表面帶有陽(yáng)離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染部分本身具有陽(yáng)離子或陰離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料就被堆積下來(lái)。染色法可以顯示出活細(xì)胞內(nèi)的某種天然結(jié)構(gòu)存在的真實(shí)性，且不影

4、響細(xì)胞的生命活動(dòng)。　　Gimesa是一種復(fù)合染料，即為酸性染料與堿性染料的結(jié)合物。在水溶液中電離為帶正電和負(fù)電的染料離子。,三、實(shí)驗(yàn)材料、用品1. 器材： 解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃勻漿器，尼龍織物，離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機(jī)等。2. 材料： 兔肝臟, 玉米黃化苗,3. 試劑：(1) 0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羥甲基氨基甲 烷(Tris)-鹽酸緩沖液(pH7.4)(2)

5、60; 1%詹納斯綠B(Janus green B)染液。(3)  姬姆薩染液（Giemsa）。(4)  1/15 mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）(5) 卡諾（Cornay）固定液。(6) 生理鹽水,四、實(shí)驗(yàn)步驟(一) 兔肝細(xì)胞線粒體及細(xì)胞核的分離 （動(dòng)物材料）1.制備肝細(xì)胞勻漿： 實(shí)驗(yàn)前將白兔空腹12小時(shí)，脫臼處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干水，稱取肝組織0.3g

6、，剪碎；用預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后加1.5 ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液，分?jǐn)?shù)次添加蔗糖溶液，冰浴中用玻璃勻漿器將肝制成勻漿，肝勻漿用雙層紗布過(guò)濾(濾液制兩張涂片①②).,,涂片過(guò)程：,3. 分離物鑒定：（1） 細(xì)胞核：將涂片①③（不加蓋玻片）自然干燥后加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min，蒸餾水漂洗數(shù)秒，用濾紙吸干水，用顯微鏡（40×）檢查，細(xì)胞核呈紫

7、紅色，混雜的細(xì)胞質(zhì)為淺藍(lán)色碎片。（2） 線粒體：取線粒體沉淀滴在載玻片上，得涂片②④，勿太密。滴加1-2滴1%詹納斯綠B溶液染色，10分鐘后加蓋玻片，吸水紙吸走多余染料，用光學(xué)顯微鏡觀察，線粒體呈藍(lán)綠色，小棒狀或啞鈴狀。,(二) 玉米線粒體及細(xì)胞核的分離（植物材料） 從植物細(xì)胞分離線粒體，除了作線粒體功能研究外，在植物細(xì)胞遺傳工程中，常用于分離核外基因――線粒體DNA等目的。 分離線粒體的方法仍采用均勻介質(zhì)中

8、的差數(shù)離心。介質(zhì)中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二價(jià)陽(yáng)離子，Ca2+除去后細(xì)胞間粘著解體，促使組織分散成單個(gè)細(xì)胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在細(xì)胞外面，并作為競(jìng)爭(zhēng)性底物削弱蛋白酶的作用。,1.試劑1）分離介質(zhì)：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的 Tris-HCl緩沖液（pH7.4），3 mmol/L EDTA，0.75 mg/ml BSA。2）保存液：0.3 mol/L 甘露醇（pH7

9、.4）。 3）20% NaClO溶液。4）1% 詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。2.器材剪刀，漏斗，研缽，紗布，離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機(jī)等。,3.實(shí)驗(yàn)方法1）剪取1～2cm長(zhǎng)的幼苗黃化苗0.5g，剪碎；加2.0 ml預(yù)冷的分離介質(zhì)，冰浴上研磨成勻漿。2）勻漿用雙層紗布過(guò)濾(濾液制兩張涂片①).3）濾液700g離心10分鐘，除去核和雜質(zhì)沉淀。4）上清夜10000g離心15分鐘，沉淀為線粒體制涂片②5）涂片①②未干時(shí)

10、，立即滴加1% 詹納斯綠B染液，染色10分鐘，蓋上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍(lán)綠色圓形顆粒。,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果光學(xué)顯微鏡觀察，線粒體呈藍(lán)綠色，小棒狀或啞鈴狀。,六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.分別描述2張細(xì)胞核涂片的結(jié)果(如平均每個(gè)視野中 所見(jiàn)完整的細(xì)胞核數(shù)量，完整的細(xì)胞或帶有殘留細(xì) 胞質(zhì)的細(xì)胞核的約占多少等)2.分別描述鼠和水稻黃化苗的兩張線粒體裝片的觀察 結(jié)果,根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,你認(rèn)為所分離的線粒體的 純度如何?3.