抗體技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化

1、抗體技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化,,,,,,細(xì)胞表面抗原,血型抗原,組織相容性抗原,,白細(xì)胞分化抗原,,,,CD2CD3CD25CD10CD20CD38CD45CD71CD41CD42CD8,...,,腫瘤相關(guān)抗原,胃癌,肺癌,肝癌,鼻咽癌,大腸癌,宮頸癌,乳腺癌,結(jié)腸癌,卵巢癌,,,,,,,,,胰腺癌,喉癌,腦膠質(zhì)瘤,骨肉瘤,,,,,,,病毒,HFRSV,新城疫,甲肝,輪狀,登革,乙肝,RSV,乙腦,,,,,,,,,流感

2、,馬雅羅Mayaro,基孔貢亞Chikungunya,Ross River,羅斯河,蓋塔Getah,柯薩奇,狂犬,新培斯Sindbis,,,,,,,,,,,,,,,,,,細(xì)菌,大腸桿菌,沙門(mén)氏菌,痢疾桿菌,軍團(tuán)桿菌,結(jié)核桿菌,綠膿桿菌,麻風(fēng)桿菌,霍亂弧菌,,,,,,,,,,寄生蟲(chóng),血吸蟲(chóng),瘧原蟲(chóng),弓形蟲(chóng),旋毛蟲(chóng),絲蟲(chóng),毛滴蟲(chóng),絳蟲(chóng),利什曼原蟲(chóng),,,,,,,,,,可溶性抗原,酶,血漿蛋白,毒素,細(xì)胞因子,補(bǔ)體,激素,小分子

3、化合物,,,,,,,,,抗體技術(shù)的研究和抗體的研發(fā)，是生物技術(shù)發(fā)展的永恒主題 抗體廣泛用于臨床疾病的診斷和研究 目前在美國(guó)單克隆抗體類藥物已占FDA所批生物藥的3/4,,,第一章抗體類型和抗體技術(shù)發(fā)展,第一代 多克隆抗體 第二代 單克隆抗體 第三代 基因工程抗體 第四代 全人抗體 ？,,,鼠源單抗臨床應(yīng)用的障礙,● 血清半衰期短，20h● 抗原抗體結(jié)合力、親和力不夠● 募集效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生副作用● H

4、AMA反應(yīng)：8－10天出現(xiàn)，20－30天高峰，anti-id封閉與抗原結(jié)合位點(diǎn)，抗鼠抗體加速單抗清除● 過(guò)敏性休克,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,影響單抗與靶細(xì)胞或抗原結(jié)合,引起變態(tài)反應(yīng)和器官損害,HAMA反應(yīng)示意圖,,,第一代 多克隆抗體 第二代 單克隆抗體 第三代 基因工程抗體 第四代 全人抗體 ？,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

5、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,小鼠抗體,嵌合抗體,重構(gòu)抗體,人源抗體,鼠 100% 33% 10% 0人 0 67% 90% 100%,第一代 多克隆抗體 第二代 單克隆抗體

6、 第三代 基因工程抗體 第四代 全人抗體 ？,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,小鼠抗體,嵌合抗體,重構(gòu)抗體,人源抗體,鼠 100% 33% 10% 0人 0 67%

7、 90% 100%,,? 人—鼠嵌合抗體? 改型抗體（又稱人源化抗體）? 小分子抗體? 雙特異抗體? 抗體融合蛋白,基因工程抗體的類型,,,1、嵌合抗體   將人Ig C區(qū)與鼠Ig V區(qū)相連接，從而在同一抗體分子中含有不同屬來(lái)源的抗體。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,構(gòu)建嵌合抗體的基本原理，從雜交瘤細(xì)胞基因組中分離和鑒別出功能性可變區(qū)

8、基因，與人Ig恒定區(qū)基因相連接，插入適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建成人—鼠嵌合的重鏈和輕鏈基因，然后共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合抗體。,表1 FDA批準(zhǔn)上市的單克隆抗體藥物,,2、改型抗體 應(yīng)用CDR移植技術(shù)，即將鼠單抗V區(qū)中互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）序列取代人源抗體相應(yīng)CDR序列，重構(gòu)成既具有鼠源性單抗特異性，又保持人抗體親和力的CDR移植抗體（CDR-grafted Ab），也稱為改型抗體或人源化抗體。,表1 FDA批準(zhǔn)上市的

9、單克隆抗體藥物,,3、小分子抗體 利用細(xì)菌表達(dá)決定抗體特異性的結(jié)構(gòu)域，所獲抗體片段大小僅為IgG分子的1/3-1/12，因此稱之為小分子抗體。,,小分子抗體包括： Fab 1/3 Fv 1/6 ScFv 1/6 單域抗體 1/12 MRU,,Fab片段 Fab片段由重鏈VH加CH1及完整的輕鏈構(gòu)成，在細(xì)菌的啟動(dòng)子控制

10、下，在大腸桿菌中表達(dá)而合成Fab，大小為完整抗體的1/3，其結(jié)構(gòu)與木瓜蛋白酶消化完整抗體后所產(chǎn)生的Fab片段一致。用DNA重組技術(shù)制備的嵌合Fab片段，其V區(qū)為鼠源性，而CH1、Cκ為人源性的。,,FV片段 FV片段由VH和VL組成，是抗體的抗原結(jié)合部位，分子量只有完整分子的1/6。采用共價(jià)結(jié)合的FV片段，在不改變其分子大小的情況下，可避免VH或VL的解離。,,,,單域抗體和最小識(shí)別單位 單域抗體是指VH或V

11、L，其分子大小僅為完整抗體的1/12。由單個(gè)CDR構(gòu)成的小分子抗體稱為最小識(shí)別單位（MRU）。,,,,單鏈抗體 單鏈抗體分子是由一條單一肽鏈按VH-Linker-VL 或VL-Linker-VH 的順序組成。分子大小是完整抗體分子的1/6，ScFv是抗體與抗原結(jié)合的最小單位。,,,ScFv具有以下特點(diǎn)：● 具有與原親本抗體相同的特異性和親和力，但由于分子很小，免疫原性弱，克服了完整抗體不易到達(dá)靶細(xì)胞、清除慢和易引起超敏反應(yīng)及組

12、織損傷等缺點(diǎn)；● 制備流程較其他基因工程抗體簡(jiǎn)單，可由大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生；,,● 無(wú)Fc段，所以減少了與非靶細(xì)胞上Fc受體結(jié)合，使其更特異性集中于靶細(xì)胞部位，有利于作為載體用于藥物的導(dǎo)向治療； ● 易進(jìn)行分子改造，ScFv基因片段還可以與適當(dāng)?shù)拿富蚧蚨舅氐鞍谆蛑亟M，轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)，可產(chǎn)生出酶聯(lián)抗體或具有與抗原結(jié)合特異性和細(xì)胞毒性的重組免疫毒素。,,4. 雙特異抗體(bispecific antibody,BsAb)

13、 一個(gè)抗體分子中的兩個(gè)抗原結(jié)合部位可分別結(jié)合兩種不同的抗原決定簇。,,制備： 化學(xué)偶聯(lián)技術(shù) 基因工程技術(shù) 二次雜交瘤技術(shù),,,在導(dǎo)向治療中的應(yīng)用藥物導(dǎo)向 腫瘤細(xì)胞抗原 BsAb 效應(yīng)物（細(xì)胞毒素等）細(xì)胞導(dǎo)向 腫瘤細(xì)胞抗原 BsAb 效應(yīng)細(xì)胞（CTL、LAK等）,,,雙特異性抗體,抗人肝癌單抗 /抗人 CD3單抗 抗Her2/neu單抗/抗人CD16單抗 抗人CD20單抗/抗

14、人CD3單抗 抗人卵巢癌單抗/抗人CD3單抗,,,,,,5. 抗體融合蛋白和免疫毒素 將編碼抗原結(jié)合部位的基因片段（Fab或Fv段）與毒素或酶的基因融合在一起，可將特定的生物活性物質(zhì)導(dǎo)向特定部位。,,,,,,抗體融合蛋白,抗人卵巢癌單抗-IL-12,血吸蟲(chóng)病抗獨(dú)特型抗體-IL-12,表1 FDA批準(zhǔn)上市的單克隆抗體藥物,,,,,,重組免疫毒素,借助DNA重組技術(shù)，將編碼抗體和毒素的基因連接在一起，產(chǎn)生的免疫毒素為重組免

15、疫毒素。白喉毒素 相思豆毒素 假單胞菌外毒素優(yōu)點(diǎn)：高效、非特異性毒性較低、體內(nèi)穩(wěn)定性較好、易穿透腫瘤、安全,,,,,全人抗體的研究,鼠-人雜交瘤 人-人雜交瘤 轉(zhuǎn)人Ig基因組小鼠 抗體庫(kù)技術(shù) 非雜交瘤技術(shù)制備單抗,,通過(guò)基因轉(zhuǎn)染方法改良鼠骨髓瘤細(xì)胞，篩選穩(wěn)定的鼠-人嵌合細(xì)胞，使融合的雜交瘤細(xì)胞遺傳性穩(wěn)定，不易丟失染色體，可長(zhǎng)期、穩(wěn)定地分泌全人單克隆抗體。,鼠-人雜交瘤技術(shù),,鼠-人雜交瘤技術(shù),問(wèn)題： 鼠源成分殘留

16、 穩(wěn)定性差 染色體丟失,,人-人雜交瘤技術(shù),問(wèn)題：能穩(wěn)定分泌抗體的親本細(xì)胞很難獲得穩(wěn)定性差染色體易丟失,,人-人雜交瘤技術(shù) 英國(guó)劍橋大學(xué)Karpas A(2001)報(bào)道建立了人-人雜交瘤技術(shù)，獲得Karpas 707H人骨髓瘤細(xì)胞株，可制備全人抗體。,,,,,,,轉(zhuǎn)入人的Ig基因組,,,,,免疫動(dòng)物,全人抗體,基因敲除小鼠,轉(zhuǎn)人Ig基因組小鼠,,,抗體庫(kù)技術(shù),,基礎(chǔ)： PCR技術(shù)的建立 抗體分子在

17、大腸桿菌的功能性表達(dá) 噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展,,,,,,抗體庫(kù)的種類： ● 初期的抗體庫(kù) ● 噬菌體抗體庫(kù) ● 大容量抗體庫(kù),,,,,,人淋巴細(xì)胞　　　　 　 抗原篩選產(chǎn)生特異克隆 RT-PCR　　　　 輕鏈重鏈基因　　　　　　　　　 　轉(zhuǎn)印至NC DNA重組　 組合抗

18、體庫(kù)　　　　　　　　　　 E.coli隨機(jī)表達(dá),1.初期抗體庫(kù),,,,,,,,,噬菌體抗體（phage antibody）是將克隆的人Ab V區(qū)基因與一種絲狀噬菌體DNA上的基因-Ⅲ或基因Ⅷ精確連接，轉(zhuǎn)染細(xì)菌后在其膜表面表達(dá)Fab段（或單鏈抗體）-噬菌體外殼蛋白（基因-Ⅲ或基因Ⅷ產(chǎn)物）的融合蛋白。,2. 噬菌體抗體庫(kù),,,這種噬菌體在一定意義上講相當(dāng)于一個(gè)人B細(xì)胞克隆，將B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來(lái)與噬菌體DNA相連，導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)使

19、之表達(dá)，可制備人全套抗體，稱為噬菌體抗體庫(kù)。,,,問(wèn)題： 1、從未經(jīng)免疫動(dòng)物的抗體庫(kù)獲得的抗體其親和力不高,,,,,,抗體體內(nèi)生成的理論,抗原刺激前，機(jī)體具有抗體初級(jí)庫(kù) 抗原刺激后，抗體生成的細(xì)胞群體被選擇，并發(fā)生克隆性增殖。 在抗原的反復(fù)刺激下，抗體的V區(qū)發(fā)生高頻率突變，產(chǎn)生高親和力抗體的細(xì)胞被選擇，抗體進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換，最終抗體成熟。,,抗體親和力改造,鏈替換(Chain Shuffling),計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)下的

20、定點(diǎn)突變,高親和力克隆的選擇,,,2、抗體庫(kù)的庫(kù)容不足以涵蓋某種動(dòng)物的抗體多樣性,,,,,,,,3.大容量抗體庫(kù) ??? 天然抗體庫(kù) 半合成抗體庫(kù) 全合成抗體庫(kù),,,,,,抗體庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)： 1.多數(shù)外源抗原對(duì)人體有害，不能隨意對(duì)人體進(jìn)行免疫。噬菌體抗體無(wú)須免疫，可直接從非免疫動(dòng)物抗體庫(kù)中篩選出特異性抗體，并能篩選針對(duì)該物種自身抗原的抗體； 2.輕、重鏈隨機(jī)組合的多樣性多于供體B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的多樣性，構(gòu)建一種噬

21、菌體抗體文庫(kù)，可供產(chǎn)生針對(duì)多種特異性抗原的人源抗體，從而克服了難以建立人-人雜交瘤的困難； 3.細(xì)菌增殖快，培養(yǎng)成本低廉，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，為臨床大量應(yīng)用抗體提供了可能。,,,,,,,總抗體庫(kù)（master library）人們將有望在原核系統(tǒng)模擬體內(nèi)免疫過(guò)程，并任意克隆針對(duì)任何抗原的抗體。,,,,,,非雜交瘤技術(shù)制備單抗,人B淋巴細(xì)胞,轉(zhuǎn)染EB病毒及生長(zhǎng)因子,B細(xì)胞永生化,,,,,,,,,,,,,,Humira是Abbo

22、tt/CAT公司開(kāi)發(fā)的一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的抗體藥物， 2002年上市，是完全人源化單抗，這是抗體藥物發(fā)展具有里程碑意義大事，預(yù)示著抗體藥物一個(gè)迅猛發(fā)展的新時(shí)代的來(lái)臨。2003年有4億美元的銷售額，2005年達(dá)到11億美元。Avastin 2003年上市的治療結(jié)腸癌的抗體藥物，也是第一個(gè)從抗體庫(kù)中篩選出的 Fab 段抗體藥物。 Avastin的上市使公司的股價(jià)上升了90億美元。,,,第二部分抗體的應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化研究,,,單克隆抗體的應(yīng)

23、用,,,,,基礎(chǔ)研究,預(yù) 防,治 療,診 斷,,,,,,,? 抗體是生化、免疫學(xué)、生物芯片等多種診斷試劑中的核心生物原料，在各種疾病的診斷領(lǐng)域具有廣泛的用途。我國(guó)目前用于臨床診斷方面的抗體80% 依靠進(jìn)口。國(guó)外已批準(zhǔn)的診斷性單抗有600多種，我國(guó)僅60余種。,單克隆抗體用于診斷,,單克隆抗體用于疾病診斷,傳染病診斷,腫瘤診斷,免疫性疾病診斷,內(nèi)分泌疾病診斷,血液病診斷,,,? 心腦血管疾病、腫瘤、神經(jīng)退

24、行性疾病、傳染病、自身免疫性疾病和內(nèi)分泌性疾病等日益威脅著人類的健康。針對(duì)這些重要疾病，要不斷研究和開(kāi)發(fā)新的治療藥物。雖然化學(xué)藥物一直占據(jù)主流地位，但抗體藥物導(dǎo)向性強(qiáng)、副作用小、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)吸引了越來(lái)越多的投資。,單克隆抗體用于治療,,,單克隆抗體用于疾病治療,腫瘤,自身免疫性疾病,器官移植,心血管疾病,感染性疾病,,,表1 FDA批準(zhǔn)上市的單克隆抗體藥物,,,,,,美國(guó)已上市18種單克隆抗體藥物 2002年銷售額 29億美

25、元 2003年 40億美元 2005年 90億美元 2008年 150億美元 2010年 300億美元,,,,,,,,2002年完全人源化單抗humira獲得批準(zhǔn)上市，這是單克隆抗體藥物發(fā)展具有里程碑意義大事。Humira是Abbott/CAT公司開(kāi)發(fā)的一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的單克隆抗體藥物，2003年有4億美元的銷售額，2005年達(dá)到11億美元。,,Avastin 是美國(guó)F

26、DA批準(zhǔn)的治療結(jié)腸癌的抗體藥物，也是第一個(gè)從抗體庫(kù)中篩選出的 Fab 段抗體藥物。 Avastin的上市使公司的股價(jià)上升了90億美元。,,赫賽?。ㄓ⑽拿?Trastuzumab ），抗人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER-2)的人源化單克隆抗體，用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌。 有25%-30%原發(fā)性乳腺癌患者HER2過(guò)度表達(dá)。,,抗體藥物臨床應(yīng)用廣泛，市場(chǎng)需求巨大?？贵w藥物已占FDA批準(zhǔn)生物技術(shù)藥的3/4，所有新研發(fā)藥物的1/3。,,,我國(guó)治療用抗體

27、的研制現(xiàn)狀,,中國(guó)僅有3個(gè)治療性單抗藥物獲準(zhǔn)上市抗乙腦中和抗體（鼠源）肺癌治療性抗體（嵌合抗體）肝癌治療性抗體（鼠源片斷）,,血吸蟲(chóng)病治療性抗體狂犬病治療性抗體禽流感治療性抗體鼻咽癌治療性抗體肝癌治療性抗體,,,? 抗獨(dú)特型抗體疫苗（anti-id Ab vaccine）,單克隆抗體用于預(yù)防,,———————————————— 動(dòng) 物 保護(hù)力（%）

28、 ———————————————— 昆明種 50.46 C57BL/6 42.05 BALB/c 39.53 山羊 42.78

29、 BALB/c（同濟(jì)） 40.50 ————————————————,血吸蟲(chóng)病抗獨(dú)特型抗體疫苗動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn),,,,,,,,單克隆抗體用于基礎(chǔ)研究,細(xì)胞種類及亞型的分析,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究,細(xì)胞膜受體及其功能研究,蛋白質(zhì)分離、純化,基因分離及功能研究,,單克隆抗體用于食品與環(huán)境監(jiān)測(cè),,,,食品,水,土壤,,抗體的大規(guī)模生產(chǎn),發(fā)酵罐轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器轉(zhuǎn)基因植物反應(yīng)器兔抗體雞抗體

30、 20只雞蛋/月/一只雞 100mgIgY/一只蛋黃,,,我國(guó)抗體工程研發(fā)中存在的主要問(wèn)題,基因工程抗體表達(dá)量低,動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)落后,,新抗體研究滯后,,今后抗體藥物發(fā)展的方向,尋找新的靶抗原 建立高通量抗體制備和篩選技術(shù) 基于抗原立體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和改造抗體 基于抗原-抗體相互作用設(shè)計(jì)抗體模擬物,基因工程抗體制備技術(shù)日臻成熟，全人抗體研究具有誘人的前景，臨床應(yīng)用有望進(jìn)一步擴(kuò)大，我國(guó)在抗體工