胚胎凍融原理及技術(shù)進(jìn)展

1、胚胎凍融原理及技術(shù)進(jìn)展,,一、冷凍胚胎概念,采取特殊的保護(hù)措施和降溫程序，使胚胎在-196℃的條件下停止代謝，而升溫后又不失去代謝恢復(fù)能力的一種長(zhǎng)期保存技術(shù)。,二、冷凍胚胎適應(yīng)癥,移植當(dāng)日母體數(shù)據(jù)不達(dá)標(biāo)，不適合移植；有多余胚胎。,缺點(diǎn)：凍胚復(fù)蘇有可能導(dǎo)致降級(jí)或損失。,三、胚胎的選擇,原核期胚胎 原核期時(shí)間短； 細(xì)胞較大，對(duì)冷凍技求高； 對(duì)原核期胚胎的發(fā)育潛能判斷難度大。,卵裂期胚胎：Ⅰ-Ⅲ級(jí),,囊胚期胚胎：

2、3CC 以上可利用囊胚。,,囊胚冷凍優(yōu)勢(shì): 囊胚期表面積與體積比大，對(duì)脫水復(fù)水造成的體積變化耐受性好；囊胚期細(xì)胞數(shù)多，損傷后修復(fù)能力強(qiáng)，少數(shù)細(xì)胞死亡后對(duì)胚胎發(fā)育能力影響小。,卵裂期胚胎與囊胚期胚胎冷凍復(fù)蘇移植,臨床妊娠率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；囊胚期胚胎冷凍復(fù)蘇移植的胚胎種植率優(yōu)于卵裂期胚胎冷凍復(fù)蘇移植，流產(chǎn)率要高于卵裂期胚胎冷凍復(fù)蘇移植。Zeng M, Su S, Li L. e: a meta-analysis.J As

3、sist Reprod Genet. 2018, 35(1):127-134.,四、 慢速冷凍及解凍技術(shù),依靠冷凍保護(hù)劑，慢速降溫速率以及置冰來(lái)減少和避免細(xì)胞內(nèi)冰結(jié)晶的形成，以及滲透壓變化和溫度變化對(duì)胚胎的打擊?？捎糜谂咛グl(fā)育的各個(gè)階段，如受精卵、分裂期和囊胚期的胚胎。,1. 儀器及試劑,生物冷凍儀，麥管試劑：PROH，PROH+Sucrose，glycerol,2. 分裂期細(xì)胞慢速冷凍流程,3. 分裂期細(xì)胞解凍流程,4. 囊胚期細(xì)

4、胞慢速冷凍流程,5. 囊胚期細(xì)胞解凍流程,6. 慢速冷凍缺點(diǎn),冷凍操作時(shí)間長(zhǎng)；需高度精確的程序化冷凍儀。,五、玻璃化冷凍技術(shù),玻璃化冷凍：通過(guò)高濃度的冷凍保護(hù)劑在一定的降溫速率下，由液相直接轉(zhuǎn)變成為一種玻璃狀的固體狀態(tài)的過(guò)程。,1. 冷凍載體和試劑,冷凍載體：冷凍載桿(Cryotop)、冷凍薄膜( cryotop)、冷凍環(huán)(Cryoloop)、冷凍葉片(cryoleaf)、拉細(xì)麥管(Open pulled straw)等。玻璃化試劑

5、： ①基本操作液BS：Modified HTF+20%血清蛋白替代物（SPS） ② 預(yù)平衡液ES：以BS為基礎(chǔ)液配制7.5%DMSO+7.5%EG ③玻璃化冷凍液VS：以BS為基礎(chǔ)液配制15%DMSO+15%EG+0.5MSucrose,2.從原核到囊胚階段胚胎的玻璃化冷凍,ES,VS1,VS2,預(yù)平衡 玻璃化,,囊胚冷凍前進(jìn)行人工皺縮( 對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞層進(jìn)行激光穿刺，使囊胚腔內(nèi)液體流出，囊

6、胚腔塌陷，再進(jìn)行冷凍減少冰晶的產(chǎn)生) 后再行冷凍。,3. 玻璃化冷凍胚胎的復(fù)溫,清洗液(WS)：mHTF+20%SPS；復(fù)溫液(TS)：以WS為基礎(chǔ)液配制1.0mol/L的蔗糖液； 復(fù)蘇液(DS)：以WS為基礎(chǔ)液配制0.5mol/L的蔗糖液。,4. 玻璃化冷凍的優(yōu)缺點(diǎn),降溫速度快(500～20 000℃/min)，無(wú)冰晶形成； 耗時(shí)較短； 無(wú)需昂貴儀器； 復(fù)蘇后存活率高。,,保護(hù)劑毒性。開(kāi)放載體：交叉污染。對(duì)細(xì)胞超微

7、結(jié)構(gòu)的影響：玻璃化冷凍時(shí)巨大的滲透壓變化及高濃度冷凍保護(hù)劑會(huì)引起滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛數(shù)量的減少，對(duì)質(zhì)膜、線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器都可能造成影響。操作機(jī)械性損傷：人為技術(shù)熟練程度；激光輔助也可能會(huì)因其熱效應(yīng)而影響胚胎發(fā)育。,六、胚胎解凍,卵裂期胚胎存活標(biāo)準(zhǔn)：解凍2h 后有＞ 50%細(xì)胞完好透亮。囊胚解凍存活標(biāo)準(zhǔn)：解凍培養(yǎng)后囊胚重新擴(kuò)張到具有正常內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層形態(tài)。,影響凍融胚胎存活的因素,胚胎質(zhì)量冷凍保護(hù)劑冷凍載體凍融方法,

8、,玻璃化冷凍胚胎比程序化冷凍胚胎能獲得更高的凍融胚胎存活率、完全胚胎存活率及臨床妊娠率。Rienzi L, Gracia C, Maggiulli R, et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrifica