體外診斷試劑膠乳比濁法學(xué)習(xí)

1、膠乳免疫比濁法相關(guān)知識(shí)膠乳免疫比濁法相關(guān)知識(shí)很多公司開展了熒光膠乳免疫層析做定量分析及膠乳增強(qiáng)免疫比濁分析項(xiàng)目，關(guān)注膠乳標(biāo)記技術(shù)的技術(shù)人員越來越多。本人總結(jié)了部分膠乳微球標(biāo)記技術(shù)，并加以分類，以便朋友們查閱：膠乳微球物理吸附：膠乳微球物理吸附：反應(yīng)微球帶磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用來設(shè)計(jì)被動(dòng)吸附蛋白?；撬峄⑶虮砻婧瑤в胸?fù)電荷的磺酸基團(tuán)，pka大約為2，因此在酸性pH保持穩(wěn)定。醛基微球表面也帶有磺酸基團(tuán)，但能和蛋白行程

2、共價(jià)鍵。羧基微球表面含帶負(fù)電荷的羧基基團(tuán)，在pH5.0以上時(shí)保持穩(wěn)定。帶有疏水基團(tuán)的蛋白的吸附和配位結(jié)合，是最簡(jiǎn)單和直接的標(biāo)記方法。這種方法中，微球溶液和含目標(biāo)蛋白的溶液混合，反應(yīng)后，未結(jié)合的游離蛋白通過清洗步驟除去，從而獲得膠體蛋白復(fù)合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸鹽、羧基、醛基表面修飾的微球）。醛基表面修飾微球是一個(gè)特例，其疏水吸附結(jié)果取決于后來的共價(jià)結(jié)合。雖然物理吸附是不依賴pH的，但反應(yīng)緩沖液的pH對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)有非常大的

3、影響，從而影響蛋白吸附到微球上的反應(yīng)效率。一般，在被吸附蛋白等電點(diǎn)附近pH時(shí)，物理吸附效率會(huì)很高。反應(yīng)步驟：1.用反應(yīng)緩沖液系數(shù)蛋白到10mgml；2.用反應(yīng)緩沖液系數(shù)膠乳微球到1%；3.將蛋白溶液加入到膠乳微球溶液中，10ml膠乳中加入1ml蛋白溶液。室溫?cái)嚢璺跤?hr；4.離心或超濾，除去未結(jié)合蛋白；5.將微球蛋白復(fù)合物用儲(chǔ)存緩沖液溶解。注意事項(xiàng)：1.最優(yōu)蛋白標(biāo)記量影響因素1）有效比表面積：粒徑減小時(shí)，比表面積mg微球值得增加；2）

4、膠體穩(wěn)定性：蛋白對(duì)膠乳有穩(wěn)定和去穩(wěn)定作用；3）免疫反應(yīng)：最近標(biāo)記量由免疫反應(yīng)需要決定。2.膠乳微球中加入蛋白后，快速攪拌混合，利于反應(yīng)均衡。反應(yīng)體積是1ml時(shí)，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打數(shù)次。如果反應(yīng)體積較大時(shí)，用燒杯，邊攪拌邊加入蛋白，3.儲(chǔ)存緩沖液和反應(yīng)緩沖液不同時(shí)，抗體有脫落的可能；4.表面活性劑能使得抗體從膠乳中脫落，所以應(yīng)避免加入。微球共價(jià)結(jié)合抗體方法：微球共價(jià)結(jié)合抗體方法：一、一步法1.準(zhǔn)備50mMpH6.0的re

5、actionbuffer，醋酸或MESbuffer更合適2.用reactionbuffer溶解抗體，使其濃度為1mgmL。3.用reactionbuffer懸浮微球，使其濃度為1%wv4.邊攪拌邊將一倍體積的抗體溶液加入到10倍體積的微球懸液中，室溫下持續(xù)攪拌20分鐘5.準(zhǔn)備濃度為10mgml（52umolmL）的EDC溶液，用前準(zhǔn)備，現(xiàn)配現(xiàn)用。6.將計(jì)算需求量的EDC溶液加入到上述微球懸液中。(Note6).7.室溫下，立即調(diào)節(jié)pH(

6、Note7).8.移除未結(jié)合的蛋白，并將包被微球用stagebuffer重懸。(Note34)B.兩步法為了避免EDC將相鄰微球之間的蛋白偶聯(lián)導(dǎo)致微球聚集或者蛋白之間交流，兩步法偶聯(lián)抗體更合適。兩步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。兩步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer來溶解，從蛋白的穩(wěn)定性方面和加速蛋白和活化微球之間的交聯(lián)速度方便考慮，是非常有利的。5.此試劑和水反應(yīng)，因此，溶解后應(yīng)立刻使用掉。6.EDC的用量，根據(jù)微

7、球表面羧基濃度來計(jì)算。根據(jù)計(jì)算所需量，每mol的羧基應(yīng)該再多加2~3mol的EDC。但是，根據(jù)功能性檢測(cè)結(jié)果，還需要進(jìn)一步的優(yōu)化。7.此步驟，微球的凝集經(jīng)常能觀察到。因?yàn)榻酉聛淼牟襟E中，EDC會(huì)將相鄰兩個(gè)微球上的抗體連接起來從而引起微球凝集或者中和微球表面的羧基或者兩者情況都發(fā)生。調(diào)節(jié)pH到6.5或超過6.5，優(yōu)化共價(jià)反應(yīng)，對(duì)微球的分散有幫助。如果反應(yīng)結(jié)束后微球凝集現(xiàn)象仍然發(fā)生，用新鮮的buffer清洗除去多余的EDC和游離的蛋白，一般

8、會(huì)使得凝集顆粒再分散。如果在最終的產(chǎn)品中凝集依然發(fā)生，嘗試稀釋微球，一開始可以稀釋到原來的50%濃度。如果稀釋后凝集依然發(fā)生，可以嘗試在所有reactionbuffer中加入Tween20或TergitolNP9等非離子型表面活性劑。這些表面活性劑不會(huì)干擾顆粒的活性或共價(jià)結(jié)合，但是需要注意的是，要確保在這種去污劑存在下微球共價(jià)結(jié)合的抗體的穩(wěn)定。9.加入乙醇胺，可以和加入蛋白反應(yīng)后多余的羧基位基團(tuán)反應(yīng)。膠乳標(biāo)記過程中常見問題：膠乳標(biāo)記過程

9、中常見問題：1）問題：蛋白無法吸附到微球上。解決方法：加入更多的蛋白；去除微球中的表面活性劑，釋放其占據(jù)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)；引入中間物，將微球與蛋白相連；改變緩沖液。2）問題：標(biāo)記時(shí)加入了大量的蛋白，但是仍然無活性。解決方法：改變蛋白加入量，從而改變蛋白與微球結(jié)合的空間構(gòu)象；使用表位稀釋物，占據(jù)微球上的部分蛋白結(jié)合位點(diǎn)，防止蛋白靠的太近。3）問題：清洗去除未吸附蛋白后，微球聚集。解決方法：增加蛋白標(biāo)記量或封閉劑的用量，防止有空余位點(diǎn)；4）問

10、題：標(biāo)記后開始活性很好，儲(chǔ)存一段時(shí)間后，活性降低。解決方法：降低儲(chǔ)存溫度到2~8度；降低儲(chǔ)存液中的封閉劑濃度，防止抗體被替換；確認(rèn)儲(chǔ)存液中無能與抗體競(jìng)爭(zhēng)的雜質(zhì)，防止長(zhǎng)時(shí)間取代抗體。5）PS微球與蛋白（抗體）交聯(lián)后，當(dāng)時(shí)沒發(fā)現(xiàn)有凝集，但隔夜后發(fā)現(xiàn)有凝集是偶聯(lián)效率低的原因。當(dāng)體系蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交聯(lián)后還空出許多反應(yīng)基團(tuán)時(shí)，由于這些基團(tuán)又可以與相連微球上的蛋白反應(yīng)，結(jié)果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些blocker

11、agents解決常見的是BSA，另外，也可提高微球的交聯(lián)率。但為什么是過一段時(shí)間后才出現(xiàn)凝集呢，這是因?yàn)槲⑶蚺悸?lián)上蛋白后，相互之間由于攜帶同種電荷的關(guān)系，比較穩(wěn)定（所以能以膠體樣存在），只有當(dāng)偶爾相互碰撞，遇上彼此的反應(yīng)基團(tuán)時(shí)才能結(jié)合。6）抗體偶聯(lián)至羧基PS球，即時(shí)檢測(cè)效果很好，但置于37度2天后，抗體活性似乎下降很大。可能共價(jià)結(jié)合未成功，如果是這樣，那么最主要的原因是EDAC質(zhì)量差或過期了。EDAC長(zhǎng)期放在空氣中會(huì)吸潮，水汽會(huì)降低ED

12、AC活性。另一個(gè)可能原因是凝集。觀察膠乳是否有凝集產(chǎn)生。還有，交聯(lián)蛋白前有沒有清洗？我們提供的膠乳緩沖液中含有表面活性劑，可能干擾抗體的結(jié)合。如果未發(fā)生凝集，而且用前已經(jīng)清洗，那么我們建議換新的EDAC。7）EDC活化羧基乳膠微球后，加蛋白（抗體）即時(shí)有沉淀出現(xiàn)，是什么原因？很多因素可以導(dǎo)致蛋白加入后，微球聚集成塊。通常，蛋白偶聯(lián)前的聚集與緩沖液（電解質(zhì)）有關(guān)?？赡苁囚然鶝]有活化好。EDC質(zhì)量出現(xiàn)問題了，請(qǐng)換質(zhì)量好的再嘗試。如果沒有好的

13、EDC，可以適當(dāng)調(diào)低活化緩沖液的pH值。對(duì)非修飾微球，那么可以從以下方面著手解決：絕大多的微球制備過程中，加有脂肪酸乳化劑。在聚合時(shí)，它起乳化作用，在聚合后，它起穩(wěn)定劑作用，使微球以膠體樣分布。在堿性pH下，微球表面的COOH，脂肪酸分子上的COOH以及聚苯乙烯多聚鏈末端的硫酸根（SO42）使微球表面帶負(fù)電荷，親水性增強(qiáng)，從而能形成穩(wěn)定的膠體。由緩沖液導(dǎo)致的聚集可以通過加蛋白，陰離子乳化劑，非離子乳化劑（如TritonX100和Twee