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1、PAGE膠及銀染詳細(xì)步驟膠及銀染詳細(xì)步驟[轉(zhuǎn)載轉(zhuǎn)載]生物信息學(xué)2010120220:03:10閱讀234評(píng)論0字號(hào)：大中小訂閱PAGE膠及銀染詳細(xì)步驟變性聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來(lái)分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析，其裝載的樣品量大，回收DNA純度高，長(zhǎng)度僅相差0.1%(即1

2、000bp中的1bp)的核苷酸分子即能分離。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)和過(guò)硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長(zhǎng)鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N一亞甲雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑）參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠。聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑的濃度及比例決定的，不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍見(jiàn)下表.丙烯酰胺(%)有效分離范圍(bp)溴酚蘭二甲苯青3.5100～

3、20001004605.080～500652608.060～4004516012.040～200307015.025～150156020.010～1001245表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對(duì)數(shù)目(bp)。一器材及試劑1.電泳儀，垂直電泳槽及其附件，玻璃板，常用實(shí)驗(yàn)器材等。2.玻璃板處理試劑：（1）KOH甲醇溶液：5gKOH溶于100ml甲醇中，用于清洗玻璃板。（2）95%乙醇（3）親和硅烷溶液：95%乙醇4

4、ml冰乙酸20ul親和硅烷20ul（4）玻璃硅烷：用移液器取適量于短板上，用無(wú)塵擦拭紙涂抹均勻。2.丙烯酰胺溶液45%4.灌膠：把梳子取出，用注射器取大約50ml的膠溶液，緩緩地使膠溶液注入兩板間，等膠溶液快要溢出時(shí)，把玻璃板放平，倒插梳子，用夾子夾緊使梳子和玻璃博間沒(méi)有縫隙從而防止點(diǎn)樣時(shí)串樣，整個(gè)過(guò)程不要產(chǎn)生氣泡。5.凝固：灌完膠后，放于室溫讓其自然凝固，觀察膠邊沿出現(xiàn)折射線就表明膠以凝固。凝膠可立即使用，或保存于室溫24小時(shí)，4℃4

5、8小時(shí)。三聚丙烯酰胺凝膠電泳1.固定玻璃板于電泳儀：取掉玻璃板上的夾子，撕掉膠帶，用清水沖洗干凈玻璃板，短板向里固定于電泳儀支架上，即凹口板面向電泳液。2.預(yù)電泳：取5xTBE200ml稀釋到1000ml制成1xTBE。向電泳儀下端槽內(nèi)倒1xTBE約500ml，向上槽倒1xTBE，使液面高于短板上沿。拔出梳子，并用注射器吸取適量電泳液把點(diǎn)樣孔洗干凈（因?yàn)槭嶙尤〕龊?，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表

6、面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則）。打開(kāi)變壓器，調(diào)節(jié)電壓為80W，預(yù)電泳30min。3.電泳:1）上樣：插入梳子，在預(yù)電泳期間把選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物94℃變性10min后，迅速置于冰上冷卻。向選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中按2：1的比例加上樣緩沖液并混勻，取56ul上樣。2）調(diào)節(jié)電壓60W，電泳2小時(shí)左右。根據(jù)指示劑遷移位置來(lái)判定是否終止電泳。電泳完畢，關(guān)掉電泳儀。取下玻璃板，用冰袋冷卻，準(zhǔn)備顯色。聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出10ng以上量的DNA條帶.要

7、求更高的靈敏度，可用銀染。四聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色銀染銀染的原理：銀離子和DNA結(jié)合，還原劑甲醛把銀離子還原成銀顆粒，使DNA條帶呈黑褐色而顯現(xiàn)出來(lái)。其靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收。1.固定：固定液冰醋酸：150ml（10%）雙蒸水：1350ml把經(jīng)冷卻的膠板置于盛有1.5L的塑料盤中，搖床震蕩30min左右。2.洗膠：把經(jīng)固定的膠板置于盛有1.5L雙蒸水的塑料盤中清洗兩次，每次24min。3.染色：染色液硝酸銀