同時檢測動物肌肉中26種β2-興奮劑和激素殘留

1、同時檢測動物肌肉中同時檢測動物肌肉中26種β2興奮劑和激素殘留興奮劑和激素殘留【摘要】建立了動物肌肉中10種β2興奮劑、16種激素共26種促蛋白合成劑的固相萃取樣品前處理方法，用同位素內(nèi)標(biāo)結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行分析。動物肌肉經(jīng)過β葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶酶解，酶解液通過SLW固相萃取柱濃縮凈化，先用甲醇洗脫16種激素，然后用5%氨化乙酸乙酯洗脫10種β2興奮劑，后者經(jīng)過雙三甲基硅基三氟乙酰胺1%（φ）三甲基氯硅烷衍生后，用G

2、CMS測定β2興奮劑；前者再用SLH固相萃取柱凈化，七氟丁酸酐衍生后用GCMS測定激素。結(jié)果表明SLW固相萃取柱能夠很好地分離動物肌肉酶解液中10種β2興奮劑、16種激素結(jié)合GCMS測定，本方法檢出濃度為0.5～1.0μgkg，回收率在68.2%～10３.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.５%～12.4%?！娟P(guān)鍵詞】促蛋白合成劑β2興奮劑激素多種殘留氣相色譜質(zhì)譜本文系浙江省衛(wèi)生廳優(yōu)秀青年人才基金（No.2006QN007）、浙江省重點科研農(nóng)

3、業(yè)基金（No.2005C22029）和浙江省重大科技攻關(guān)基金（No2005C12007）資助項目Email:pgwu@cdc.1引言畜產(chǎn)品生產(chǎn)過程濫用促蛋白合成劑（主要有激素、β2興奮劑）對食品安全、生態(tài)環(huán)境造成直接及潛在的危害。20世紀(jì)80年代以來許多國家或組織通過立法來限制或禁止在食用動物養(yǎng)殖中使用促蛋白合成劑。我國也禁止將促蛋白合成劑用于動物促生長目的。由于利益驅(qū)動，在世界范圍內(nèi)激素和β2興奮劑仍被大量濫用。國內(nèi)外對動物肌肉

4、中激素、β2興奮劑多殘留確認(rèn)檢測技術(shù)文獻(xiàn)報道很多，主要有氣相色譜質(zhì)譜法(GCMS)[1～8]、液相色譜質(zhì)譜法(LCMS)[9～12]，但所采用的方法很少涉及上述兩大類藥物多殘留的同時檢測。動物性食品中獸藥殘留由于殘留物水平很低，樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，要盡可能除去與目標(biāo)物同時存在的雜質(zhì)，減少色譜干擾峰，避免檢測器和色譜柱污染，因此樣品預(yù)處理約占工作量的70%，樣品的分離純化是獸藥殘留分析中費時和費力的步驟，多類獸藥殘留集成化檢測

5、技術(shù)和獸藥提取凈化技術(shù)是今后研究的熱點，固相萃取技術(shù)、同位素稀釋技術(shù)近年來在復(fù)雜樣品藥物殘留檢測中得到廣泛應(yīng)用[1～12]。本研究考慮到動物肌肉中激素、β2興奮劑檢測均需要先用β葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶酶解，因此考慮兩大類藥物殘留的同時檢測。本研究采用SLW混合型固相萃取柱作為動物肌肉中促蛋白合成劑多殘留測定前處理技術(shù)，先將上述兩類藥物在SLW柱上富集后分別洗脫，然后用GCMS分別測定26種促蛋白合成劑(10種β2興奮劑、16種

6、激素)殘留，結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。2實驗部分2.1儀器與試劑6890GC5973MS氣相色譜質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）勻質(zhì)機(jī)超聲清洗器旋渦混勻器。特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚、甲基睪丸酮、炔諾酮、炔雌醇、炔諾孕酮、睪丸酮、雌二醇、雌三醇、雌酮、黃體酮、丙酸睪酮、醋酸甲地孕酮、戊酸雌二醇、醋酸甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%Sigma公司）；馬布特羅、HP5MS5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管

7、柱(30m0.25mm，0.25μm)；進(jìn)樣口溫度280℃柱溫程序：初溫120℃（3min）10℃／min280℃（5min）；載氣為高純氦氣（99.999%），流速0.9mLmin，不分流進(jìn)樣。EI離子源溫度230℃；電子能量70eV；接口溫度280℃；電子倍增器電壓1506V；溶劑延遲：10min。3結(jié)果與討論3.1樣品酶解、凈化動物肌肉中激素、β2興奮劑殘留都以游離或軛合物兩種形式存在，僅檢測游離部分可以不用酶解，檢測軛合物或者

8、總量時都需要用蛋白酶、β葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶水解后測定，本研究先用β葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶水解釋放激素、β2興奮劑軛合物再進(jìn)行同時測定。采用具有反相和陽離子交換作用的SLW固相萃取柱，萊克多巴胺萊克多巴胺（D5ractopamineractopamine）。分別用甲醇、5%氨化乙酸乙酯洗脫獲得組分1和組分2，兩者分別含有激素和β2興奮劑，組分1還含有較多雜質(zhì)，再用正相SLH柱凈化獲得組分3，經(jīng)過七氟丁酸酐衍生后測定激

9、素殘留，組分2經(jīng)過BSTFA1%（mV）TMCS衍生后測定β2興奮劑殘留。3.2樣品測定3.2.1β2興奮劑類藥物殘留測定本研究同時測定β2興奮劑和激素殘留，樣品酶解后水解液用SLW固相萃取柱凈化利用其陽離子交換性質(zhì)富集、凈化動物肌肉中β2興奮劑殘留，用10mL5%氨化乙酸乙酯洗脫SLW固相萃取柱獲得β2興奮劑組分2。10種β2興奮劑及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)硅烷化衍生后測定總離子流圖見圖1，具體的監(jiān)測離子參考文獻(xiàn)[6]，動物肌肉空白與加

10、標(biāo)總離子流圖見圖2。由圖2可知，10種β2興奮劑經(jīng)過酶解、SLW凈化后完全可以滿足實驗要求。從總離子流圖上看，與其它陽離子交換固相萃取柱如MCX、SLS[6]比較，除了萊克多巴胺處基線有所升高外，其它β2興奮劑均無明顯區(qū)別，這說明混合型SLW固相萃取柱陽離子交換功能完全可以用于樣品β2興奮劑凈化，且其反相吸附功能對樣品凈化無干擾。3.2.2β2興奮劑檢測方法檢出限、回收率及精密度用本方法對動物組織進(jìn)行10種β2興奮劑標(biāo)準(zhǔn)加入回

11、收實驗，各化合物添加水平如表1，每個水平重復(fù)測量5次。實驗結(jié)果見表1。由表1可知，在2.0μgkg添加水平，上述10種β2興奮劑的平均回收率為75.4％～89.6％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2％～12.2％；在4.0μgkg的添加水平，平均回收率范圍為80.5％～98.5％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.7％～8.2％；在8.0μgkg的添加水平，平均回收率范圍為85.3％～108.2％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.3％～7.8％；按照信噪比SN=3：1計算本方法β

12、2興奮劑類藥物殘留的檢出限為0.5～1.0μgkg之間。3.2.3激素類藥物氣相色譜質(zhì)譜分析GCMS法測定動物肌肉中激素殘留，一般需要先進(jìn)行硅烷化或者酰化衍生，以提高檢測靈敏度，前者衍生試劑主要有BSTFA、MSTFATMSIDTE等[5，13～15]，后者主要有七氟丁酸酐[13，17]。本研究比較了上述3種硅烷化和?；苌噭ο铝?6種同化激素的衍生效果，發(fā)現(xiàn)硅烷化試劑不能對醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮進(jìn)行衍生化，使這兩者激素在測定