上海地區(qū)規(guī)模化豬場蚊媒及其攜帶病毒的調(diào)查.pdf

1、蚊媒屬于節(jié)肢動(dòng)物門、昆蟲綱、雙翅目、長角亞目。蚊科分為3個(gè)亞科，即巨蚊亞科(Toxorhynchitinae)、按蚊亞科(Anophelinae)和庫蚊亞科(Culicinae)，其種類繁多，迄今全世界已知種類達(dá)40個(gè)屬，200多種。
　　蚊媒病毒是由吸血蚊媒作為媒介進(jìn)行傳播的，主要是通過蚊媒叮咬敏感的脊椎動(dòng)物。病毒首先在蚊媒的體內(nèi)利用蚊媒自身的成分不斷繁殖，然后蚊媒病毒再被蚊媒傳給脊椎動(dòng)物，最終引起人畜共患病，引起了很嚴(yán)重的公共

2、衛(wèi)生健康問題。蚊媒病毒病大多屬于自然疫源性疾病，在流行季節(jié)從自然界捕獲的媒介蚊媒分離蚊媒病毒，是了解當(dāng)?shù)匚妹讲《玖餍械闹匾侄沃弧?br>　　上海市是全球最大的港口之一，人口密度大，流動(dòng)性強(qiáng)，來自世界各地的大量人群和物資可攜帶各種蚊媒及其病原至上海市。盡管每年只有少量輸入性蚊媒病病例報(bào)告，但在當(dāng)前的環(huán)境下仍有可能形成蚊媒傳染病發(fā)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)。為有效預(yù)防控制蚊媒病的傳播和流行，幫助疾病控制部門開展公共衛(wèi)生安全保障工作，本研究于2014年

3、對上海地區(qū)大型規(guī)?；i場進(jìn)行蚊媒與蚊媒病毒調(diào)查，分析了上海地區(qū)蚊種構(gòu)成、分布及蚊媒病毒的攜帶情況，為上海當(dāng)?shù)氐奈妹郊拔妹讲《镜念A(yù)防控制提供依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下:
　　試驗(yàn)一.上海地區(qū)蚊媒調(diào)查
　　2014年6月、7月、8月集中在上海市閔行區(qū)，奉賢區(qū)，浦東區(qū)，嘉定區(qū)共11家大型規(guī)?；B(yǎng)豬場，采用紫外捕蚊燈進(jìn)行捕獲，前一晚的六點(diǎn)在豬場3m高處懸掛捕蚊燈并打開開關(guān)至第二天的早晨六點(diǎn)收集樣本。將蚊媒樣本存放入隨身攜帶的小冰箱內(nèi)，立

4、即送回實(shí)驗(yàn)室。送回實(shí)驗(yàn)室后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可以先拿出一部分進(jìn)行品種分選，后續(xù)實(shí)驗(yàn)用的先保存于實(shí)驗(yàn)室的液氮罐中。結(jié)果:此次試驗(yàn)共采集到3屬7種30396只蚊媒標(biāo)本，其中三代喙庫蚊（Culex tritaeniorhynchus）共采集了28856只，占捕獲總數(shù)的95％;二代喙庫蚊（Culex bitaeniorhynchus）采集了688只，占捕獲總數(shù)的2.26％，中華按蚊（Anopheles sinensis）捕獲的數(shù)量是789只，占總數(shù)的

5、2.6％;其它4種不常見蚊媒（騷擾阿蚊、微小按蚊、致倦庫蚊、淡色庫蚊）共63只，占捕獲總數(shù)的0.18％。
　　試驗(yàn)二，上海地區(qū)蚊媒攜帶病毒的分離與鑒定
　　將已經(jīng)按照蚊媒品種分類的蚊媒樣本進(jìn)行充分的研磨，后經(jīng)3日齡小鼠腦內(nèi)擴(kuò)增和細(xì)胞上（BHK-21和C6/36）增值。參考Genbank中常見的蚊媒病毒如乙型腦炎病毒、甲病毒、黃病毒、辛德畢斯病毒、版納病毒的基因序列，應(yīng)用primer5.0軟件設(shè)計(jì)了特異性的引物，并通過RT-P

6、CR擴(kuò)增條帶，回收產(chǎn)物，連接載體后送測序;同時(shí)使用間接免疫熒光法(IFA)進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。結(jié)果:本次試驗(yàn)共分離到16株蚊媒病毒，其中8株是乙型腦炎病毒（2株來自豬源，其余6只來自蚊源），8株版納病毒（均來自蚊源）。
　　試驗(yàn)三.上海地區(qū)蚊媒攜帶的乙型腦炎病毒的分子特征分析
　　參考GenBank中已發(fā)表的JEV核苷酸序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了兩對JEV特異性引物，使用QIAamp Virus RNA Mini K

7、it(Qiagen)試劑盒提取病毒RNA，對提取的RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA鏈，對反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。測序結(jié)果經(jīng)BLAST后，再利用DNAStar軟件包及MEGA4.0等軟件進(jìn)行序列分析、JEV進(jìn)化樹的構(gòu)建，核苷酸序列和氨基酸序列比較及分析。用JEV分離株腦內(nèi)接種3日齡小鼠，梯度稀釋病毒后，依次加入培養(yǎng)有BHK-21細(xì)胞單層的96孔板，設(shè)置陰性對照孔，逐日記錄病變孔數(shù)，通過Reed-Muench兩氏法計(jì)算TCID5

8、0。結(jié)果表明:分離的8株JEV病毒都有較強(qiáng)的致病性，選用Chen等建立的JEV基因分型方法進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建分析，結(jié)果顯示:此次分離到的8株JEV毒株，其中有4株為GⅠ（蚊源的有3株，豬源的1株），有4株為GⅢ（蚊源的3株，豬源的1株）。8株分離株與經(jīng)典毒株SA14-14-2的E基因核苷酸差異性為88％-98.2％，氨基酸差異性是86.5％-97.9％。JEV分離株之間的核苷酸差異是88.0％-100％,氨基酸差異是86.3％-100％。<

9、br>　　試驗(yàn)四.上海地區(qū)蚊媒攜帶的版納病毒的分子特征分析
　　在Genbank上下載版納病毒序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了針對BAV第12片段的特異性引物，進(jìn)行擴(kuò)增回收，并連接T載體后送測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST后，再利用DNAStar軟件包及MEGA4.0等軟件進(jìn)行序列分析、BAV進(jìn)化樹的構(gòu)建，核苷酸序列和氨基酸序列比較及分析。結(jié)果顯示:上海首次分離到版納病毒，版納病毒的8個(gè)分離株之間的核苷酸序列比較，同源性都很高，可