探針設計原則

1、原位雜交探針大體可分為三類：寡核苷酸探針，cDNA探針，RNA探針。寡核苷酸探針由25bp左右的核苷酸組成，通?？梢杂晒竞铣?，由于其序列較短，因此特異性較強，原位雜交時可以區(qū)分家族基因，同一基因的不同剪切體，cDNA探針長約500bp左右，可以通過非對稱PCR擴增合成，由于探針式DNA，可以有效的避免降解，但DNA和RNA的結(jié)合不如RNA與RNA結(jié)合強，通常不采用，RNA探針長約500bp左右，通過體外轉(zhuǎn)錄合成，如果設計合理，其特異性

2、是可以得到保證的，其主要缺點是容易被RNAse酶降解。查看原位雜交相關的文獻發(fā)現(xiàn)，2000年以前的原位雜交常使用放射性標記的寡核苷酸探針，通過膠片曝光來顯色，2000年以后的文獻常使用RNA探針。許多腎臟發(fā)育的文獻雖然有很多原位雜交數(shù)據(jù)，但卻沒有附帶上探針序列或者用于探針模板克隆的引物，通過了解廈門黃老師斑馬魚和昆明毛炳宇爪蟾中原位雜交探針設計方法，我們可以采用RNA探針。文獻中很難找到關于RNA探針設計的原則，有的文獻報道直接用cDN

3、A合成RNA探針。借鑒爪蟾中原位雜交探針設計流程，以小鼠FGF10的探針設計為例進行介紹。1.在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載該FGF10的mRNA全序列，然后用FGF10的全長在NCBI中進行BLAST比對分析，比對數(shù)據(jù)庫選擇mousegenometran，比對程序選擇somewhatsimilarsequence。ZebrafishseqRNAs得出的比對結(jié)果中有一幅圖譜，顯示比對序列與數(shù)據(jù)庫中序列的相似性，探3421aatctctagaag

4、aactaggtatctttttttacttttattttaaaataataattatacctg3481acacatgaccatggaccacccacaaccaaaattaaatgtttggggagacaaactatagta3541ttcagtgacaagggtaacagcaaatagtgcagacgttggattcttatttcactttgccat3601ttagattactaaagagactatgtgtaaacagtcatcatta

5、tagtactcaagacattaaac3661agcttctagcaaaatgtatcaaagcttgcagagtccaaaaatagaaaacatctttccccc3721tctcccaccctacatttccccctgtatgcatcctaacagagat底紋標注的為引物序底紋標注的為引物序列3.將設計好的探針序列在UCSC上再次比對分析，genome選擇mouse，querytype選擇translatedRNA，點擊submi