拼接和修復(fù)操作流程

1、1拼接和修復(fù)操作流程一：拼接：拼接1、引物登記：新引物到時，認(rèn)真核對引物條數(shù)，按照基因名詳細(xì)記錄在引物登記本上。2、溶引物：將引物按順序隔排排放到96孔平板上，（注意將GR基因兩條重復(fù)的首尾引物各取出一條）向每管引物中加入300ul1TE，并在每管管蓋上標(biāo)記出基因名稱和引物序列號，注意不要錯標(biāo)。測序引物單獨(dú)拿出來，交由測序人員保存，用時再溶解。3、振引物：將每板引物用渦旋震蕩器震蕩均勻，每板引物震蕩時間不少于2分鐘。4、寫拼接方案：根據(jù)

2、每條基因的引物條數(shù)對其進(jìn)行分段，每段引物在1218條之間，標(biāo)示出各段的基因長度，并依據(jù)基因的平均Tm值以及GC%選擇一個合適的退火溫度。一般退火溫度稍高于平均Tm值，并根據(jù)GC%進(jìn)行調(diào)整。若GC%大于60%時，要適量加入DMSO，最后寫好基因的重疊延伸方案。5、混引物：按照拼接方案的分段方法，對各段引物進(jìn)行混合，每條引物取5ul混合于1.5ml離心管中，充分震蕩，混合均勻。6、準(zhǔn)備反應(yīng)：找到各段的首尾引物，按順序與混合引物排列好，準(zhǔn)備好

3、一管滅菌水和總管。總管配置方法如下：5pfuBuffer10ul40400ulpfuDNA聚合酶0.6ul24uldNTP1ul40ulH2O13.4ul540ul注意配置總管是要確保每個成分的質(zhì)量，每次新領(lǐng)取的成分用之前要檢測。7、預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)：反應(yīng)體系如下：反應(yīng)程序下：混合引物3ul1、94℃2min2、94℃20s3、退火溫度4℃20s總管25ul4、72℃14sH2O22ul5、94℃20s6、退火溫度20s7、72℃14s8、9

4、4℃20s9、55606520s10、72℃14s11、72℃2min注意：配好反應(yīng)體系后要離心，確保PCR管中沒有氣泡。如有氣泡會影響Pfu酶的活性。其中24號程序是個降落PCR（TouchdownPCR）每個循環(huán)退火溫度下降1度，運(yùn)行4循環(huán)，57號程序運(yùn)行8個循環(huán)，810號程序，運(yùn)行8個循環(huán)。其中延伸溫度根據(jù)片段大小決定，pfu的聚合速度為1kb30s8、二次擴(kuò)增反應(yīng)：3程序是194度2min294度20s3設(shè)定的退火溫度值20s4

5、72度13s572度3min2至4號程序跑18個循環(huán)（5）膠回收：在PCR產(chǎn)物下來之前須注意一下是否有回收膠。PCR產(chǎn)物下來后在板上排好順序，加入一點(diǎn)loadingbuffer，拿好膠，進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣時盡量減少損失。在膠跑好前，寫好2mL的EP管。膠跑好后，核對片段大小，割膠（膠需割得較薄，以保證沒有雜帶混入）；加入450uL的溶膠液（即使膠非常厚45mL已經(jīng)足夠，加入過多的溶膠液，在下面的步驟中容易引起污染）放入63度下水??；寫好套管

6、和1.5mLEP管并排序（注意不注意不能寫錯管子和弄錯順序能寫錯管子和弄錯順序）；在觀察膠已溶好后，將其轉(zhuǎn)至套管中，并其按順序排在離心機(jī)上；3000rmin（相對于5000rmin其更利于DNA的吸附），1分鐘；10000rmin，30S（很關(guān)鍵，時間太短可能會導(dǎo)致DNA中殘留溶膠液，影響測序反應(yīng)，時間太長可能導(dǎo)致少量DNA損失）；倒掉溶膠液，加入漂洗液，5000rmin，1min；倒掉，再漂洗一次；倒掉漂洗液后，10000rmin，1

7、min(關(guān)鍵步驟，時間太短會引起酒精殘留，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)）；將套管轉(zhuǎn)至1.5mL的管中，放入烘箱，3－4min；取出，加入30uLTE（加至管底，而不是打在管壁上）。（6）繼續(xù)做下一輪PCR，直至得到所需基因全長。（7）模板、原始質(zhì)粒、稀釋質(zhì)粒和修復(fù)引物的整理：原始質(zhì)粒用已寫上日期的小袋裝好，放于冰箱中；稀釋質(zhì)粒和模板按照日期排序于96孔板上，約一個月以前的東西整理倒袋子中。這樣只要查一下修復(fù)本和修復(fù)方案本就可以迅速找到所需東西。一般一個

8、月內(nèi)的東西十分鐘內(nèi)能找到，一個月以前的東西半小時內(nèi)能找到。（8）基因進(jìn)度整理：修復(fù)方案本上的方案在其被謄寫到修復(fù)本上時，在此方案前打勾，在此方案被完成后，用紅筆在其右側(cè)標(biāo)上連接編號和日期（以保證沒有漏做的基因）。每天中午時候觀察平板生長情況，如遇不好情況，采取相應(yīng)措施；對于難做的基因盡量多花時間，盡快做完，從而不影響基因的整體進(jìn)度。一般的修復(fù)方案盡量在當(dāng)天就完成，最遲第二天，必須完成。2.修復(fù)中可能出現(xiàn)的問題以及注意事項(xiàng)（1）看膠時出現(xiàn)

9、一系列異常情況：所有片段都沒有出，或只有個別片段有很弱的帶，說明總管有問題，或個人實(shí)驗(yàn)中出錯；一條基因的全部片段都沒有出，可能是原始質(zhì)粒拿錯，或退火溫度不對；一條基因的部分片段沒出，說明此基因的部分引物不好、原始質(zhì)粒（一般原始質(zhì)粒都好用）不好，或該基因的此片段處于GC高峰或低谷處，也有可能東西拿錯；雜帶呈現(xiàn)幾條比較清晰的帶，可能是模板加入量太多或兩模板加入的量懸殊太大；雜帶呈現(xiàn)為，主帶上面彌散呈一片，說明該基因重復(fù)序列嚴(yán)重。（2）對于難

10、擴(kuò)的基因：基因中存在GC%高峰或低谷的片段，可以單獨(dú)拿出來用更高或更低的溫度退火（強(qiáng)行做的話，可能會出現(xiàn)缺段現(xiàn)象）；GC%含量很高，可以用68度、70度甚至72度退火，同時加入適量的DMSO；GC%含量很低的基因可以在55度或50度上退火：對于一些易出雜帶并且較弱的基因可以多跑上一些循環(huán)（較常用)，或者做2管回收時并在一起（一般情況下不用此方法因?yàn)槿鯉Ш芸赡懿⒉皇潜容^純的目的片段）；對于重復(fù)序列嚴(yán)重的基因，首先要大量稀釋模板，有些可以稀