實驗三-血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

1、實驗三實驗三血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳分析技術(shù)是目前臨床常規(guī)測定中應(yīng)用最廣的方法，具有微量、快速、簡便、吸附作用和電滲作用小、分離區(qū)帶清晰、靈敏度及分辨率高等特點。醋酸纖維素薄膜還可進(jìn)行透明化處理，便于照相和掃描計算結(jié)果。廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、脂蛋白、結(jié)合球蛋白、同工酶的分離和測定?！灸康哪康摹?.掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理、操作方法。2.了解電泳法分離蛋白質(zhì)的臨床意義?！驹?/p>

2、原理】帶電粒子在電場中向與其電性相反的電極泳動的現(xiàn)象稱為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點大多在pH4.0～7.3之間，在pH8.6的緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場中都向正極移動。由于血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，因此在同一pH環(huán)境中所帶負(fù)電荷多少不同，又由于其分子大小不同，所以在電場中泳動速度也不同。分子小而帶電荷多者，泳動速度較快；反之，則泳動速度較慢。因此通過電泳可將血清蛋白質(zhì)分為5條區(qū)帶，從正極端依次分為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、

3、β球蛋白和γ球蛋白等，經(jīng)染色可計算出各蛋白質(zhì)含量的百分?jǐn)?shù)?！酒鞑钠鞑摹看姿崂w維素薄膜（2cm8cm）、培養(yǎng)皿、濾紙、無齒鑷、剪子、加樣器（可用蓋玻片或或微量加樣器）、直尺、鉛筆、玻璃板（8cm12cm）、試管、試管架、吸管、電泳儀、電泳槽、分光光度計或吸光度掃描計。【試劑試劑】1.巴比妥緩沖液(pH8.6，0.07molL，離子強(qiáng)度0.06)稱取巴比妥鈉12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸餾水，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸餾

4、水至1000毫升。2.氨基黑10B染色液稱取氨基黑10B0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml混勻，加蒸餾水至100ml。3.漂洗液甲醇45ml、冰醋酸5ml，混勻后加蒸餾水至100ml。4.洗脫液0.4mol／LNaOH溶液。5.透明液時斷電。4.染色用無齒鑷小心取出薄膜，浸于染色液中1～3分鐘（以清蛋白帶染透為止）。染色過程中應(yīng)輕輕晃動染色皿，使薄膜與染色液充分接觸，薄膜量較多時，應(yīng)避免彼此緊貼而影響染色效果。5.漂洗準(zhǔn)備3個培養(yǎng)

5、皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜，依次在漂洗液中連續(xù)浸洗數(shù)次，直至背景無色為止。將漂凈的薄膜用濾紙吸干，從正極端起依次為清蛋白（A）、α1、α2、β及γ球蛋白（圖33）。6.定量(1)洗脫法：取6支試管，編號，分別為A、α1、α2、β、γ和空白管。于清蛋白管加入0.4molLNaOH溶液4ml其余5管加2ml。剪下各條蛋白區(qū)帶，另于空白部分剪一條與各蛋白區(qū)帶寬度近似的薄膜作為空白，分別浸入各管中，振搖數(shù)次，置37℃水浴20分鐘，使色澤

6、完全浸出。用620nm波長以空白管調(diào)零比色，讀取各管吸光度，按下式計算：T=A2α1α2βγ清蛋白%＝清蛋白管吸光度2T100α1球蛋白%＝α1球蛋白管吸光度T100α2球蛋白%＝α2球蛋白管吸光度T100β球蛋白%＝β球蛋白管吸光度T100γ球蛋白%＝γ清蛋白管吸光度T100(2)掃描法：待染色的醋酸纖維素薄膜完全干燥，置透明液中約3分鐘，取出貼于玻片上，薄膜完全透明。將已透明的薄膜放入全自動光密度計中，對蛋白區(qū)帶進(jìn)行掃描，自動繪出電