抗原修復(fù)方法及注意事項(xiàng)

1、檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)法(強(qiáng)烈推薦)1.適用范圍：適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)，其效果優(yōu)于微波修復(fù)法和直接煮沸修復(fù)法使得免疫組化結(jié)果更加可靠2.儀器設(shè)備：市售不銹鋼家用壓力鍋，大小尺寸可根據(jù)需要而定(內(nèi)徑18cm為好)；10001500W電爐一臺(tái)；不銹鋼或耐高溫塑料切片架。3.所需試劑：0.01M檸檬酸型緩沖液，pH=6.00.14.操作步驟：(1)常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸餾水中

2、待用。(2)取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液(8001500ml)于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中。蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽，從噴汽開始計(jì)時(shí)，12分鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫(稍冷后，可在自來(lái)水籠頭下加速冷卻)，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS(pH=7.27.4)沖洗兩次，每次3分鐘(23)。(3)按有關(guān)試劑盒的操作步驟執(zhí)行。5.注意

3、事項(xiàng)：(1)加熱時(shí)間長(zhǎng)短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時(shí)間控制在58分鐘為好，時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)使染色背景加深。(2)必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架，以防緩沖液pH值增高而導(dǎo)致掉片。(3)高壓鍋離開火源后必須等緩沖液冷切后，才能把切片取出。(4)為防止組織脫落，玻片必須經(jīng)清潔處理后，涂覆PolyLLysine((5)緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。EDTA抗原熱修

4、復(fù)法1.適用范圍：適用于部分中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)。2.儀器設(shè)備：電磁爐、不銹鋼鍋和耐高溫塑料染色架。3.所需試劑：EDTA抗原修復(fù)液，pH9.04.操作步驟：(1)抗原修復(fù)液的配制：根據(jù)所需工作液的量，取邁新公司產(chǎn)品MVS0098適量，按1:50的比例稀釋。(2)取500ml抗原修復(fù)工作液于1000ml不銹鋼鍋中，直接在電磁爐上加熱至沸騰后，調(diào)低電磁爐功率使鍋內(nèi)修復(fù)液保持微沸狀態(tài)。將組織切片置于耐高溫染色架上，再

5、將染色架緩慢放入不銹鋼鍋中(注意：若快速將染色架丟進(jìn)緩沖液中，往往會(huì)導(dǎo)致瞬時(shí)的激烈沸騰現(xiàn)象而造成組織脫落)，之后加蓋繼續(xù)加熱20分鐘。再將不銹鋼鍋從電磁爐上移開，室溫下自然冷卻至室溫后取出切片，蒸餾水洗1次3分鐘，PBS洗2次、每次3分鐘。之后進(jìn)行免疫組化染色。5.注意事項(xiàng)：(1)由于修復(fù)液蒸發(fā)量無(wú)法估計(jì)，所以修復(fù)液不能重復(fù)使用。由于修復(fù)液蒸發(fā)量無(wú)法估計(jì)，所以修復(fù)液不能重復(fù)使用。(2)工作液的量必須保證切片始終能浸泡在液體內(nèi)。(3)為了

6、防止加熱過程組織脫片，須采用PolyLLysine處理載玻片。(4)抗原修復(fù)后一定要等工作液冷卻后，才能將切片從工作液中取出。檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法1.適用范圍：適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)，其效果比高溫高壓修復(fù)差但比直接水煮好。2.儀器設(shè)備：微波爐(700800w)。也就是說當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就會(huì)越長(zhǎng)；反過來(lái)當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)則修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比

7、的關(guān)系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表一中也可以清楚地看出。如果修復(fù)強(qiáng)度不夠，免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露出的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會(huì)非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽(yáng)性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對(duì)免疫組化進(jìn)行定量的需要2、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系固定時(shí)間越長(zhǎng)的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)

8、，組織中蛋白對(duì)溫度的耐受也會(huì)相應(yīng)增高，這可能就是我們對(duì)固定時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。這就提醒我們?cè)谧龌仡櫺匝芯繒r(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長(zhǎng)修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。3、不同pH值抗原修復(fù)液對(duì)染色結(jié)果的影響抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液pH值也會(huì)對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。pH值對(duì)染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況。A—穩(wěn)定型，pH值

9、對(duì)染色結(jié)果的影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。B—V型，高pH值和低pH值染色較好，而pH值46染色結(jié)果較差，如ER、Ki67等。C—上升型，隨著pH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如HMB45等。D—下降型，隨著pH值的增加，染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象，如MOC31。一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高pH值（約pH8.0~9.0），A、B、C三者都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高pH值

10、的修復(fù)液，如1mMEDTApH8.0或pH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用pH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國(guó)外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高pH值的修復(fù)液來(lái)代替目前廣為使用的pH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用pH9.0的修復(fù)液效果都要優(yōu)于pH6.0的枸櫞酸，尤其是核

11、陽(yáng)性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高pH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢(shì)。4、抗原熱修復(fù)的手段目前抗原熱修復(fù)所采用的方法主要有微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)兩種。高壓修復(fù)具有溫度均一、節(jié)省時(shí)間、效果穩(wěn)定等特點(diǎn)。5、抗原熱修復(fù)具體操作過程可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)?？乖瓱嵝迯?fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗(yàn)證明，以1mM的EDTA抗原修復(fù)液（pH8.0或pH9.