mtt法大全

1、(MTT方法大全mtt)什么是MTTMTT溶液的配制方法|MTT濃度|MTT法實驗步驟|MTT溶液|whymeet2010011922:02MTTMTT方法大全方法大全mtt(mtt)mtt(mtt)什么是什么是MTTMTTMTTMTT溶液的配制方法溶液的配制方法|MTT|MTT濃度濃度|MTT|MTT法實驗步驟法實驗步驟|MTT|MTT溶液溶液|whymeetwhymeetMTT方法大全mtt(mtt)什么是MTTMTT溶液的配制方法

2、|MTT濃度|MTT法實驗步驟|MTT溶液|whymeet其它的聲音：1.最好用570nm波長的濾光片，因為MTT在這個波長的吸光度是峰值，換句話說靈敏度高。用其它波長的也有，一般是490nm，但我的經驗靈敏度降低一半。2.我們用的BIOTEK公司的ELx800一般值在2以下都是可靠的如果復孔之間值相差太大就要考慮是否是實驗過程中的誤差.我曾經看到園子的有些帖子報道說OD值大概在0.21.2范圍內與活細胞數有較好的線性關系，但OD值在0

3、.30.9范圍內可能更佳，若你的OD值不在這個范圍內則你實驗的細胞數可能不太合適，應調整你的細胞數。邊緣效應96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不養(yǎng)細胞，否則這四行的數據會偏高或偏低96孔板在培養(yǎng)箱中，由于濕度不夠，而培養(yǎng)箱由于具有一定的溫度，由于溫度梯度使得邊緣的孔水分蒸發(fā)較快，導致培養(yǎng)基中各種成分濃度變化增大，導致細胞狀態(tài)不同。對于這種現(xiàn)象，要保證培養(yǎng)箱中的濕度，減少開關培養(yǎng)箱的次數和時間。解決方法:將孔板周圍的一圈孔全部不用，影響非

4、常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培養(yǎng)液，只要能防止蒸發(fā)就可以.實驗前應明確的問題1.選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多

5、敏感性降低，太少觀察不到差異。2.2.藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。間。3.時間點的設定。在不同時間點的測定ODOD值

6、，輸入值，輸入excelexcel表，表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。4.培養(yǎng)時間。200ul的培養(yǎng)液對于10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48h換液的。定容1L貼壁細胞：1.收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔

7、加入100ul鋪板使待測細胞調密度至100010000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）加入濃度梯度的藥物原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般57個梯度每孔100ul設35個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況3.5%CO2，37℃孵育1648小時，倒置顯微鏡下觀察。4.每孔加入20ulMTT溶液（5mgml，即0.5

8、%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖23遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。6.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7.同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細胞：1）收集對數期細胞，調節(jié)細胞懸

9、液濃度1106ml，按次序將①補足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul；②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋lgml，需預試尋找最佳稀釋度，1:101:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5104cell孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100(儲存液1001640）。2）置37℃，5%CO2孵育1648小時，倒置顯微鏡下觀察。3）每孔加入10ulMTT溶液（5mgm

10、l，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（懸浮細胞推薦使用WST1，培養(yǎng)4h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）4）離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。5）同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、