16srdna鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、16SrDNA鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1.適用范圍適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了通過(guò)特定引物對(duì)細(xì)菌的16SrDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列分析比對(duì)，快速獲得細(xì)菌種屬信息的操作規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于未知細(xì)菌的快速種屬分析，以及為細(xì)菌的生化鑒定提供指導(dǎo)信息。2.方法和原理方法和原理16SrDNA鑒定是指用利用細(xì)菌16SrDNA序列測(cè)序的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。包括細(xì)菌基因組DNA提取、16SrDNA特異引物PCR擴(kuò)增

2、、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測(cè)序、序列比對(duì)等步驟。是一種快速獲得細(xì)菌種屬信息的方法。細(xì)菌rRNA（核糖體RNA）按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是細(xì)菌染色體上編碼16SrRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列。16SrDNA由于大小適中，約1.5Kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)較容易地得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家接受。在16SrRNA分子中，可變區(qū)序列因細(xì)菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以

3、可利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，將16SrDNA片段擴(kuò)增出來(lái)，利用可變區(qū)序列的差異來(lái)對(duì)不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。16SrDNA序列的前500bp序列變化較大，包含有豐富的細(xì)菌種屬的特異性信息，所以對(duì)于絕大多數(shù)菌株來(lái)說(shuō)，只需要第一對(duì)引物測(cè)前500bp序列即可鑒別出細(xì)菌的菌屬。針對(duì)科學(xué)論文發(fā)表或是前500bp無(wú)法鑒別的情況，需要進(jìn)行16SrDNA的全序列擴(kuò)增和測(cè)序，得到較為全面的16SrDNA的序列信息。由于測(cè)序儀一次反應(yīng)最多只能測(cè)出70

4、0bp的有效序列，為了結(jié)果的可靠性，通常將16SrDNA全長(zhǎng)序列分成3部分進(jìn)行測(cè)序。519R357F27F16SrDNA正向引物926F5AAACTYAAAKGAATTGACGG3第3部分反向引物1492R5TACGGCTACCTTGTTACGACTT3560bp左右其中M=C:AY=C:T.K=G:TR=A:GS=G:C.W=A:Tall1:14.操作流程操作流程5.實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法5.1核酸提?。汉怂崽崛。禾羧尉?，然后置于裝有1

5、00μLPrepManUltra的離心管中，渦旋震蕩混勻30s左右，然后100℃水浴10min后，以離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心3min，取10μL上清液與490μLddH2O（即稀釋50倍），混勻作為下步PCR的模板DNA。提取的DNA于20℃保存。5.2基因擴(kuò)增基因擴(kuò)增5.2.1PCR反應(yīng)體系試劑使用量（25μL體系）模板DNA2μL（10ng~100ng）Taq酶(5UμL)0.2μL10TaqBuffer(Mg2)2.5μLdNTPs(各