05—酶工程制藥

1、第五章 酶工程制藥,第一節(jié) 概述第二節(jié) 酶的分離純化第三節(jié) 酶和細(xì)胞的固定化第四節(jié) 固定化酶和固定化細(xì)胞的反應(yīng)器第五節(jié) 酶的人工模擬第六節(jié) 酶的化學(xué)修飾第七節(jié) 酶工程研究的進(jìn)展,第五章 酶工程制藥,第一節(jié) 概 述,酶工程（Enzyme Engineering）是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合、發(fā)展而形成的一門新的技術(shù)學(xué)科。它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異催化性能，并通過工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。,酶工程簡介,

2、酶工程簡介,酶工程的名稱出現(xiàn)在20世紀(jì)20年代，主要指自然酶制劑在工業(yè)上的規(guī)模應(yīng)用。 1953年，德國人提出了酶固定化技術(shù) 。1969年，日本人用固定化技術(shù)拆分了DL-氨基酸。 1971年，第一屆國際酶工程會議提出酶工程的主要內(nèi)容： 酶的生產(chǎn)、分離純化、酶的固定化、酶及固定化的反應(yīng)器、酶和固定化酶的應(yīng)用。,酶的基礎(chǔ)知識,（一）酶是生物催化劑酶是生物細(xì)胞產(chǎn)生的、具有催化能力的生物催化劑。催化高效性專一性：結(jié)構(gòu)專一性；立體異構(gòu)專

3、一性酶具有不穩(wěn)定性反應(yīng)條件溫和,6,（二）酶的化學(xué)本質(zhì),蛋白質(zhì),酶,,單純酶,結(jié)合酶,（全酶）= 酶蛋白 + 輔因子,輔因子,,輔酶,與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物。,輔基,與膜蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物。,金屬激活劑,金屬離子作為輔助因子。,7,必需基團(tuán)：這些基團(tuán)若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失。,活性部位：酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。,必需基團(tuán),,活性部位,維持酶的空間結(jié)構(gòu),,結(jié)合基團(tuán),催化

4、基團(tuán),,專一性,,催化性質(zhì),現(xiàn)代酶工程的主要內(nèi)容,酶的分離純化、大批量生產(chǎn)及新酶和酶的應(yīng)用開發(fā)； 酶和細(xì)胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究，包括酶傳感器、 反應(yīng)檢測； 酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶的研究； 酶的分子改造和化學(xué)修飾，結(jié)構(gòu)與功能的研究； 有機(jī)相中酶反應(yīng)的研究； 酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)與應(yīng)用研究； 抗體酶、核酸酶的研究； 模擬酶、合成酶及酶分子的人工設(shè)計、合成研究。,酶的來源,從生物體中提取分離化學(xué)合成：固

5、相合成多肽技術(shù),早期酶的生產(chǎn)多以動植物為主要原料,植物提供的酶主要有：蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。動物組織提供的酶主要有：胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生產(chǎn)的凝乳酶等。不適合大規(guī)模生產(chǎn)：動植物來源有限、生產(chǎn)周期長，以及地理、氣候和季節(jié)影響。,目前工業(yè)生產(chǎn)一般都以微生物為主要來源,利用微生物生產(chǎn)酶制劑，具有如下優(yōu)點：微生物種類繁多，酶的品種齊全。微生物生長繁殖快、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高。培養(yǎng)方法簡單，原料來源豐富，價格低廉。微生物具

6、有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過各種遺傳變異的手段，培育出新的高產(chǎn)菌株。所以，目前工業(yè)上應(yīng)用的酶大多采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)。,酶的生產(chǎn)菌,作為一個優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備以下幾點要求：繁殖快、產(chǎn)酶量高，酶的性質(zhì)應(yīng)符合使用要求，而且最好是產(chǎn)生胞外酶的菌。不是致病菌，在系統(tǒng)發(fā)育上與病原體無關(guān)，也不產(chǎn)生有毒物質(zhì)。這一點對醫(yī)藥和食品用酶尤為重要。產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易變異退化，不易感染噬菌體。能利用廉價的原料，發(fā)酵周期短，易于培養(yǎng)。,生產(chǎn)菌

7、的來源,從菌種保藏機(jī)構(gòu)和有關(guān)研究部門獲得。大量的需要要從自然界中分離篩選。自然界是產(chǎn)酶菌種的主 要來源，土壤、深海、溫泉、火山、森林等都是菌種采集地。篩選產(chǎn)酶菌的方法：采集、菌種的分離初篩、純化、復(fù)篩和生產(chǎn)性能檢定等。菌種改良的途徑：應(yīng)用遺傳學(xué)原理進(jìn)行基因突變、基因轉(zhuǎn)移和基因克隆。,14,目前常用的產(chǎn)酶微生物,E.coli ：是應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌。分泌胞內(nèi)酶，經(jīng)細(xì)胞破碎分離得到。在工業(yè)上用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天門冬氨酸酶、青霉素酰

8、化酶、β-半乳糖苷酶枯草桿菌：主要用于生產(chǎn)α-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、堿性磷酸脂酶。,15,,啤酒酵母：用于釀造啤酒、酒精、飲料、面包等曲酶（黑曲酶和黃曲酶）：主要生產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氨基?；负椭久浮Ｆ渌a(chǎn)酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、鏈霉菌等,16,酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用,1、在疾病診斷方面的應(yīng)用由于酶具有專一性強(qiáng)、催化效率高、作用條件溫和等顯著的催化特點，酶學(xué)診斷已經(jīng)發(fā)展成為可靠、簡便又快捷的

9、診斷方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。酶學(xué)診斷方法包括兩個方面，一是根據(jù)體內(nèi)原有酶活力的變化來診斷某些疾病，二是利用酶來測定體內(nèi)某些物質(zhì)的含量，從而診斷某些疾病。,17,（一）根據(jù)體內(nèi)酶活力的變化診斷疾病 一般健康人體內(nèi)所含有的某些酶的量是恒定在某一范圍的。當(dāng)人們患上某些疾病時，則由于組織、細(xì)胞受到損傷或者代謝異常而引起體內(nèi)的某種或某些酶的活力發(fā)生相應(yīng)的變化。故此，可以根據(jù)體內(nèi)某些酶的活力變化情況，而診斷出某些疾病。

10、,,,,,20,（二）用酶測定體液中某些物質(zhì)的變化診斷疾?。?人體在出現(xiàn)某些疾病時，由于代謝異?；蛘吣承┙M織器官受到損傷，就會引起體內(nèi)某些物質(zhì)的量或者存在部位發(fā)生變化。通過測定體液中某些物質(zhì)的變化，可以快速、準(zhǔn)確地對疾病進(jìn)行診斷。酶具有專一性強(qiáng)、催化效率高等特點，可以利用酶來測定體液中某些物質(zhì)的含量變化，從而診斷某些疾病。,,,22,2、在疾病治療方面的應(yīng)用——酶類制劑 酶可以作為藥物治療多種疾病，用于治療疾

11、病的酶稱為藥用酶。藥用酶具有療效顯著，副作用小的特點，在疾病的治療方面的應(yīng)用越來越廣泛,24,消化類：研究最早，是品種最多的一類酶.在這一類酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纖維素酶、木瓜酶、凝乳酶、無花果酶、菠蘿酶等。,健美生消化酶—幫助腸胃蠕動,25,抗炎凈創(chuàng)類：目前在治療上發(fā)展最快，用途最廣的一種。多數(shù)是蛋白質(zhì)水解酶，分解發(fā)炎部位纖維蛋白的凝結(jié)物，消除傷口周圍的壞疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能夠分解膿液中的核蛋白使成簡單的嘌呤

12、和嘧啶，降低膿液的粘性、達(dá)到凈潔創(chuàng)口、消除癡皮、排除膿液抗炎消腫的目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、雙鏈酶，α-淀粉酶、胰脫氧核糖核酸酶等。,26,血凝和解凝類：這類酶都是從血液中提取出來的。凝血酶的作用是促使血中纖維蛋白元變成不溶性纖維蛋白,從而促使血液凝固，防止微血管出血。纖維蛋白溶解酶的作用是溶解血塊，為目前臨床上最新的一種酶制品,治療血栓靜脈炎、冠狀動脈栓塞等。抑肽酶作為肽酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于體外循環(huán)手術(shù)，大劑量抑肽酶可明

13、顯減少心臟外科手術(shù)后的滲血，消除因心臟外科手術(shù)后滲血而導(dǎo)致的死亡,27,解毒類：主要作用是解除體內(nèi)或因注射某種藥物產(chǎn)生的一種有害物質(zhì)。主要品種有青霉素酶、過氧化氫酶和組織胺酶等。青霉素酶能夠分解青霉素分子中的β一內(nèi)酰胺環(huán)，使變成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的過敏反應(yīng)。,28,3、在藥物生產(chǎn)方面的應(yīng)用利用酶的催化作用將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗幬铩＿@方面的應(yīng)用日益增多?，F(xiàn)已有不少藥物包括一些貴重藥物都是由酶法生產(chǎn)的 4.在分析檢測方面的

14、應(yīng)用酶法檢測或酶法分析如：ELISA、免疫組織化學(xué)、Western blot中的HRP,,,第二節(jié) 酶的分離純化,細(xì)胞破碎酶的提取酶的分離方法酶的組合分離純化策略酶的濃縮、干燥與結(jié)晶,31,一、酶的分離純化技術(shù)路線,細(xì)胞破碎,酶提取,酶分離純化,,,酶濃縮,,,酶貯存,動物、植物或微生物細(xì)胞,,發(fā)酵液,,離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。,32,二、酶的提取,（一） 細(xì)胞破碎許多酶存

15、在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎,JY92-II D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),細(xì)胞破碎珠,高壓細(xì)胞破碎機(jī),DY89-I型 電動玻璃勻漿機(jī),33,采用緩沖體系：以防pH值大幅度變化而失活添加保護(hù)劑：防活性基團(tuán)活性中心受影響抑制水解酶的作用其它保護(hù)措施：溫度，pH值，攪拌，光照，氧化等影響,34,（二）酶的抽提,35,(三）沉淀分離,36,三、酶的純化,過濾

16、與膜分離電泳離子交換層析,第三節(jié) 酶和細(xì)胞的固定化,38,酶應(yīng)用過程中的一些不足,酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數(shù)的酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應(yīng)，這樣酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成

17、本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。 產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無疑給產(chǎn)物的進(jìn)一步的分離純化帶來一定的困難。,,固定化技術(shù),固定化技術(shù)就是為了克服酶在工業(yè)應(yīng)用中的不足，使酶催化反應(yīng)能像化學(xué)催化劑一樣在多相反應(yīng)過程中穩(wěn)定操作，并易于回收和反復(fù)使用而發(fā)展起來的一項酶化學(xué)與酶工程技術(shù)。,39,固定化酶簡介,1916年，Nelson和Griffin最先發(fā)現(xiàn)了酶的固定化現(xiàn)象。固定化酶的研究從20世紀(jì)50年代開始，1953年

18、德國的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體，經(jīng)重氮化法活化后，分別與羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核酸核糖酶等結(jié)合，制成固定化酶。20世紀(jì)60年代后期，固定化技術(shù)迅速發(fā)展。1969 年，日本千佃一郎首次應(yīng)用固定化氨基?；笍幕旌习被嶂写笠?guī)模生產(chǎn)L-氨基酸，實現(xiàn)了酶應(yīng)用史上的一大變革，開辟了固定化酶工業(yè)化應(yīng)用的新紀(jì)元。這時人們已經(jīng)預(yù)感到了固定化酶以后可以在現(xiàn)代酶工程以及整個生物工程中占有的重要作用, 它在應(yīng)用上和

19、理論上的巨大潛力吸引了生物化學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)工程和高分子等領(lǐng)域的科研機(jī)構(gòu)及企業(yè)科技部門研究人員的注意力。,40,從1970年代初開始酶的固定化技術(shù)研究發(fā)展很快，促使酶工程作為一個獨立學(xué)科從發(fā)酵工程中脫穎而出，才真正登上歷史舞臺。至1980年代初，每年約發(fā)表1000篇以上的文獻(xiàn)和近200篇專利，所報道的固定化方法達(dá)100種以上。1980年代中以后，酶和細(xì)胞固定化研究的發(fā)展速度開始減慢，從而有人認(rèn)為，對酶的固定化技術(shù)應(yīng)予以重新評價

20、，理由是盡管已經(jīng)做了大量研究工作，但工業(yè)中實際應(yīng)用的案例尚少，經(jīng)過近20年的研究，真正能獲得規(guī)模應(yīng)用的固定化酶，還僅局限于葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等為數(shù)不多的幾個酶種。,41,我國的固定化酶研究開始于1970 年, 首先是微生物所和上海生化所的酶學(xué)工作者同時開始了固定化酶的研究工作。對于固定化酶，曾經(jīng)有過固相酶、水不溶酶、固定酶等多種名稱。在1971年召開的第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會議上，確定固定化酶的統(tǒng)一英文名稱為imm

21、obilized enzyme。,（一）固定化酶的制備,1、固定化酶（immobilized enzyme）的定義：指限制或固定于特定空間位置的酶。具體講是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以是結(jié)合在菌體（死細(xì)胞）或細(xì)胞碎片上的酶或酶系。,2、固定化酶的特點,可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)

22、物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化。反應(yīng)條件易于控制，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少；比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。,固定化酶缺點,固定化時，酶活力有損失增加了生產(chǎn)成本、初始投資大只能用于可溶性底物，而且較適于小分子底物，不適宜大分子底物胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離純化于完整菌體相比不適宜多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng),3、酶和細(xì)胞固定化方法,酶的固定化（enzyme imm

23、obilization）是指采用有機(jī)或無機(jī)固體材料作為載體，將酶包埋起來或束縛、限制于載體的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重復(fù)使用的酶化學(xué)方法與技術(shù)。不使用固體材料作為載體，通過酶分子之間的相互交聯(lián)形成聚集體，也可將酶固定化，稱為無載體酶固定化．1990年代初報道的交聯(lián)酶晶體（cross—linked enzyme crystals，CLEC）就屬于無載體固定化酶 。,酶和細(xì)胞的固定化方法,,酶和細(xì)胞固定化模式,（1）載

24、體結(jié)合法,將酶結(jié)合于不溶性載體上的固定化方法。A、物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體上的固定化方法。載體如：活性碳、多孔玻璃、樹脂等。優(yōu)點：操作簡單，可選用不同電荷和不同形狀的載體，有可能固定化和純化過程同時實現(xiàn)，酶失活后載體仍可再生。缺點：最適吸附酶量無規(guī)律可循，吸附量與酶活力不一定呈平行關(guān)系，酶與載體結(jié)合力不強(qiáng)，酶易于脫落，導(dǎo)致酶活下降并污染產(chǎn)物，故不常用。,49,B、離子結(jié)合法：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不

25、溶性載體上。如：DEAE-纖維素。優(yōu)點：操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞。缺點：載體和酶的結(jié)合力弱，易受緩沖液種類或pH的影響，離子強(qiáng)度高時，酶易脫落。,離子交換劑結(jié)合蛋白能力較強(qiáng)，故常用,50,C、共價結(jié)合法：酶以共價鍵結(jié)合于載體上。即將酶分子上非活性部位功能團(tuán)與載體表面反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行共價結(jié)合的方法。優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好，不易脫落。(目前研究最為活躍的一類酶固定化方法 )缺點：載體

26、要活化，反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件劇烈，酶易失活和產(chǎn)生空間位阻效應(yīng),常常會引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并導(dǎo)致活性中心受到破壞,難以得到比活高的固定化酶，甚至底物的專一性等性質(zhì)也可能發(fā)生變化。,載體結(jié)合法 注意事項,首先要注意載體活化，使載體獲得能與酶分子的某一特定基團(tuán)發(fā)生特異反應(yīng)的活潑基團(tuán)?；罨椒ㄓ絮；?、芳基化、烷基化和氨甲?；磻?yīng)等。酶蛋白上參與共價結(jié)合的氨基酸殘基不應(yīng)該是酶催化活性所必需的，避免固定化后酶活力喪失。反應(yīng)

27、條件盡可能溫和。,（2）交聯(lián)法,采用雙功能團(tuán)試劑或多功能團(tuán)試劑進(jìn)行酶分子之間的交聯(lián)，使酶分子和雙功能團(tuán)試劑或多功能團(tuán)試劑之間形成共價鍵，得到三維的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)．常用的交聯(lián)劑：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。,53,酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價結(jié)合 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶,交

28、聯(lián)法又分：交聯(lián)酶法、酶與輔助蛋白交聯(lián)法、吸附交聯(lián)法和載體交聯(lián)法。交聯(lián)法反應(yīng)條件劇烈，固定化酶的酶活回收率低（故盡可能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間），會引起酶活性中心結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致酶活性降低（常加入輔助蛋白如牛血清蛋白提高固定化酶的穩(wěn)定性），因此常與吸附法或包埋法聯(lián)合使用。,（3）包埋法,包理法是將酶包裹于凝膠形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，或半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)使其固定化。適用于多種酶、粗酶制劑、細(xì)胞器和細(xì)胞的固定化。包埋法一般不需要與酶蛋白

29、的氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的空間構(gòu)象，酶活回收率較高，因此可以應(yīng)用于許多酶的固定化。但是包埋法制備的固定化酶，只適合用于小分子底物和產(chǎn)物的酶催化反應(yīng)，因為只有小分子反應(yīng)底物或產(chǎn)物，才可以通過高分子凝膠的網(wǎng)格進(jìn)行擴(kuò)散。由這種固定化方法產(chǎn)生的擴(kuò)散阻力，還會使固定化酶的動力學(xué)行為發(fā)生改變，從而降低酶活力。包埋法可分為網(wǎng)絡(luò)型和微囊型兩種。前者是將酶包埋于高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)絡(luò)內(nèi)；而后者是將酶包埋在高分子半透膜中制備成微囊型。,56,A、

30、網(wǎng)格型：將酶或細(xì)胞包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂。天然高分子化合物有淀粉、明膠、膠原、海藻膠、角叉菜膠。多用于固定化細(xì)胞,57,B、微囊型：將酶或細(xì)胞包埋在高分子半透膜中。通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體。顆粒比網(wǎng)格型要小得多，比較有利于底物與產(chǎn)物的擴(kuò)散，但反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。,①海藻酸鈉與CaCO3（“蛋盒”模型，形成熱不可逆凝膠）；②殼聚糖（陽離子胺基）與海藻酸鈉，通

31、過正負(fù)電荷吸引，產(chǎn)生瞬時凝膠化作用，形成聚電解質(zhì)半透膜；③殼聚糖胺基與戊二醛基形成shiff氏堿，在膠囊表面形成一層致密的保護(hù)膜，可增加微膠囊球的強(qiáng)度，能有效的防止磷脂酶從微膠囊中泄漏，而提高固定化酶的活力回收。,,,不同磷脂酶作用于磷脂部位示意圖,,,,（4） 選擇性熱變性法,專用于細(xì)胞固定化，是將細(xì)胞在適當(dāng)溫度下處理使細(xì)胞膜蛋白變性但不使酶變性而使酶固定于細(xì)胞內(nèi)的方法。,4、酶和細(xì)胞的固定化載體,載體條件：固定化過程中不引起酶變

32、性對酸堿有一定的耐受性有一定的機(jī)械強(qiáng)度有一定的親水性和良好的穩(wěn)定性有一定的疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒均勻共價結(jié)合時具有可活化基團(tuán)有耐受酶和微生物細(xì)胞的能力價廉易得、經(jīng)濟(jì)環(huán)保固定化載體主要有三類：吸附載體、包埋載體和共價結(jié)合載體,5、新型的酶固定化方法,溫和的條件下進(jìn)行，減少酶活力損失，提高固定化效率光偶聯(lián)法：光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團(tuán)的載體共價固定化酶等離子體法：高度激發(fā)的原子、分子，自由基的聚集體，載體表面

33、用等離子體修飾，引入活性基團(tuán),無載體固定化酶直接用交聯(lián)劑交聯(lián) 用交聯(lián)劑交聯(lián)溶解酶、晶體酶、物理聚集酶、和噴霧干燥酶等四種無載體酶體系，優(yōu)點如下： 催化活性高，成本低 具備較高的催化劑比表面 可加入多種酶 底物擴(kuò)散受限制少 極端條件下穩(wěn)定性高,（二）固定化細(xì)胞,通過各種方法將細(xì)胞與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞固定化。固定化細(xì)胞是指固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動的細(xì)胞。

34、固定化細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長、繁殖和新陳代謝，故也稱為固定化活細(xì)胞、固定化增值細(xì)胞、第二代固定化酶。微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞都可以制成固定化細(xì)胞。固定化細(xì)胞可以提高生產(chǎn)效率，延長生產(chǎn)周期，并易于細(xì)胞的分離和回收。目前，固定化細(xì)胞技術(shù)已應(yīng)用于食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)和三廢處理工業(yè)，經(jīng)濟(jì)效益顯著。,65,固定化細(xì)胞簡介,固定化酶和固定化菌體的應(yīng)用進(jìn)一步推動了固定化技術(shù)的發(fā)展。20世紀(jì)70年代后期出現(xiàn)固定化細(xì)胞技術(shù)。由于固定化細(xì)胞技術(shù)不需要把

35、酶從細(xì)胞中提取出來，酶活力損失少，酶活回收率較高,因此該技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)超過固定化酶的應(yīng)用。細(xì)胞被固定化后細(xì)胞密度高、反應(yīng)速度快、耐毒害能力強(qiáng)、產(chǎn)物分離容易、能實現(xiàn)連續(xù)操作，可以大大提高生產(chǎn)能力等優(yōu)勢，因此在近幾十年來固定化細(xì)胞技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。通常只能用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)。 1959 年Hattori首次將大腸桿菌E. coli 吸附在樹脂上實現(xiàn)細(xì)胞固定化，隨后固定活細(xì)胞或稱為固定化增殖細(xì)胞的研究工作相繼展開。

36、1973年, 含有L- 天冬氨酸酶的微生物被固定化, 并用于L- 天冬氨酸的生產(chǎn)。,66,1976年，法國首次用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精。1978年，日本固定化枯草桿菌細(xì)胞生產(chǎn)α-淀粉酶；1984年，中國開始進(jìn)行固定化細(xì)胞生產(chǎn)α-淀粉酶、糖化酶和果膠酶等的研究。 20世紀(jì)70年代中期以來，動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)迅速發(fā)展。動物細(xì)胞主要用于生產(chǎn)疫苗、抗體、多肽藥物、酶等功能蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)動物細(xì)胞具有貼壁生長的特性，采用固定化動物細(xì)

37、胞培養(yǎng)技術(shù)，更加具有重要意義。植物細(xì)胞也可以采用固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)。動植物細(xì)胞固定化的研究和應(yīng)用進(jìn)一步擴(kuò)展了固定化技術(shù)的研究、開發(fā)。近年來還開展了固定化動植物細(xì)胞生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的研究工作。,67,固定化細(xì)胞的優(yōu)點,①無需進(jìn)行酶的分離純化，節(jié)約酶的分離過程及費用; ②屬于多酶系統(tǒng)，可催化一系列反應(yīng)，無需輔酶再生; ③細(xì)胞生長停滯時間短，抗污染能力強(qiáng); ④固定化細(xì)胞可以重復(fù)或長期使用，簡化游離細(xì)胞培養(yǎng)過程，還減少了營養(yǎng)基質(zhì)的浪費;

38、 ⑤保持酶的原始狀態(tài)，提高酶的穩(wěn)定性; ⑥使用固定化細(xì)胞反應(yīng)塔連續(xù)發(fā)酵，可以避免反饋抑制和產(chǎn)物的消耗。,68,固定化細(xì)胞的缺點,①部分載體材料有時會對細(xì)胞產(chǎn)生生理毒性，將導(dǎo)致細(xì)胞死亡，菌體自溶，影響產(chǎn)物的純度或影響目標(biāo)代謝產(chǎn)物的生物合成;②細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會造成底物滲透和擴(kuò)散的障礙; ③有些載體材料使細(xì)胞或小細(xì)胞群體相互分隔，容易形成不利于細(xì)胞之間彼此協(xié)調(diào)的環(huán)境，影響代謝產(chǎn)物的生物合成; ④大規(guī)模制備固定化細(xì)胞過程復(fù)雜，易引起雜

39、菌污染; ⑤細(xì)胞內(nèi)有多種酶存在，會形成副產(chǎn)物; ⑥載體材料使成本提高，以至于該技術(shù)在傳統(tǒng)的發(fā)酵工業(yè)中難以推廣。,固定化細(xì)胞的制備技術(shù),細(xì)胞固定化主要適用于胞內(nèi)酶，要求底物和產(chǎn)物透過細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)不存在產(chǎn)物分解系統(tǒng)及其他副反應(yīng)。載體結(jié)合法、包埋法、交聯(lián)法、無載體法,（1）載體結(jié)合法制備技術(shù),將細(xì)胞懸浮液直接與水不溶性載體相結(jié)合。載體主要為陰離子交換樹脂、陰離子交換纖維素、聚氯乙烯。優(yōu)點：操作簡單，符合細(xì)胞的生理條件，不影響細(xì)胞的生

40、長及酶活性。缺點：吸附容量小、結(jié)合強(qiáng)度低。,（2）包埋法制備技術(shù),與包埋酶法相同，將細(xì)胞定位于凝膠網(wǎng)格內(nèi)。是固定化細(xì)胞中應(yīng)用最多的方法。常用載體有卡拉膠、聚乙烯醇、瓊脂等。優(yōu)點：細(xì)胞容量大，操作簡便，酶的活力回收率高缺點：擴(kuò)散阻力大，容易改變酶的動力學(xué)行為，不適于催化大分子底物與產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。,（3）交聯(lián)法制備技術(shù)：由于所用交聯(lián)劑戊二醛等對細(xì)胞有毒性，一般很少用。（4）無載體法制備技術(shù)：靠細(xì)胞自身的絮凝作用制備固定化細(xì)胞的技

41、術(shù)。通過助凝劑或選擇性熱變性的方法實現(xiàn)細(xì)胞的固定化。可以獲得高密度細(xì)胞，固定化條件溫和，但是機(jī)械強(qiáng)度差。此外還有粘合法，截留法等,73,（三）固定化方法與載體的選擇依據(jù),酶可以通過各種不同的方法進(jìn)行固定化，但不管是通過物理的弱相互作用，還是通過較強(qiáng)的化學(xué)鍵結(jié)合，都必須采用不溶于水的材料作為固定化載體。任何一種固定化方法或固定化載體，都不可能適用于所有的酶，要想獲得較好的固定化效果，必須根據(jù)具體的酶和催化反應(yīng)類型，選擇合適的固定化方法

42、和載體。和多相化學(xué)催化劑的制備一樣，要想通過選擇固定化方法和載體，制備出性能最佳的固定化酶，沒有現(xiàn)成的規(guī)律可循，往往依賴于實際工作經(jīng)驗的積累，最后以是否能最大限度地保留酶活性和提高酶的穩(wěn)定性為評價標(biāo)準(zhǔn)。,固定化方法的選擇依據(jù),（1）固定化酶應(yīng)用的安全性：要按照藥物和食品領(lǐng)域的檢驗標(biāo)準(zhǔn)作必要的檢查。所用試劑是否有毒性和殘留。盡可能選擇無毒性試劑。（2）固定化酶在操作中的穩(wěn)定性：在選擇固定化方法時要求固定化酶在操作過程中十分穩(wěn)定，能長期

43、反復(fù)使用，在經(jīng)濟(jì)上有極強(qiáng)的競爭力。（3）固定化的成本：包括酶、載體、試劑的費用，也包括水、電、氣、設(shè) 備和勞務(wù)投資等。注意綜合考慮。,（四）固定化酶（細(xì)胞）的性質(zhì)與指標(biāo),1、固定化酶的形狀不同材料可以制成相同形狀固定化酶，如卡拉膠、瓊脂等均可制成酶片或酶塊；同種材料也可以制成不同形狀的固定化酶，如海藻膠可以制成酶片或酶塊或酶珠。同種方法可以制成不同形狀，如包埋法可以制造酶珠、酶膠囊；而不同方法也可以制成相同形狀，如交聯(lián)法、吸附法和

44、共價法均可制造酶粉。因此，固定化酶形狀是由底物和產(chǎn)物的性質(zhì)、基質(zhì)材料的性能、固定化方法、酶反應(yīng)性質(zhì)、反應(yīng)器類型或應(yīng)用目的決定的。,（1）顆粒狀：包括酶珠、酶塊、酶片、酶粉。每種固定化方法均可制備顆粒狀，方法簡單，比表面積大，轉(zhuǎn)化效率高，適用各種反應(yīng)器。如酵母酶珠。（2）纖維狀：三醋酸纖維素用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂笈c酶混合，再用噴絲的方法就可制成酶纖維。比表面積大，轉(zhuǎn)化效率高，但只適用于填充床反應(yīng)器。此外，纖維酶可以織成酶布用于填充床反應(yīng)器

45、。,（3）膜狀固定化酶：可通過共價結(jié)合的方法將酶偶聯(lián)在濾膜上。也可用交聯(lián)等其他方法制膜酶。酶膜比表面積大，滲透阻力小，可用于酶電極，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、脲酶等酶膜。（4）管狀固定化酶：又稱酶管，利用管狀載體如尼龍、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，經(jīng)活化后與酶偶聯(lián)得酶管。酶管的機(jī)械強(qiáng)度大，切短后可用于填充床反應(yīng)器，也可組裝成列管式反應(yīng)器。目前已制備出糖化酶、轉(zhuǎn)化酶、脲酶等酶管。,2、固定化酶的性質(zhì)酶

46、經(jīng)過固定化后，其催化反應(yīng)體系由均相轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷?。由于固定化方法和所用載體的不同，固定化酶受到擴(kuò)散限制、空間障礙、微環(huán)境變化和化學(xué)修飾等因素的影響，從而導(dǎo)致酶學(xué)性質(zhì)和酶活力的變化。,（1）酶活力的變化：酶經(jīng)過固定化之后活力大都下降。原因主要：①酶活性中心的重要氨基酸與載體發(fā)生結(jié)合，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；②酶與底物結(jié)合時存在空間位阻效應(yīng)，影響活性中心對底物的定位；③包埋法中酶被高分子物質(zhì)包圍，大分子物質(zhì)不能透過膜，導(dǎo)致底物與產(chǎn)物擴(kuò)散阻力增

47、大。解決辦法：反應(yīng)條件盡可能溫和；加入抑制劑、底物或產(chǎn)物保護(hù)酶活性中心。但是，由于偶聯(lián)過程中酶得到化學(xué)修飾，或固定化過程中提高了酶的穩(wěn)定性，某些酶在固定化后酶活力得到提高。,（2）酶穩(wěn)定性的變化：穩(wěn)定性包括對溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長。其原因是限制了酶分子之間的相互作用，阻止其自溶，增加酶構(gòu)型的牢固程度。但是，當(dāng)固定化過程影響到酶活性中心和酶的高級結(jié)構(gòu)的敏感區(qū)域，也將導(dǎo)致酶活性

48、降低。,a、熱穩(wěn)定性提高：熱穩(wěn)定性越高，工業(yè)化意義越大。熱穩(wěn)定性高可以提高反應(yīng)溫度和反應(yīng)速度，提高效率。b、操作穩(wěn)定性：實際應(yīng)用的關(guān)鍵所在，通常用半衰期表示。半衰期達(dá)到1個月以上時，即具有工業(yè)應(yīng)用價值。c、貯藏穩(wěn)定性：一般不能長期貯存，現(xiàn)做現(xiàn)用，否則活力逐漸下降。若需長期保存，可在貯存液中添加底物、產(chǎn)物、抑制劑和防腐劑，并于低溫保存。d、對蛋白酶的穩(wěn)定性：大多數(shù)天然酶經(jīng)固定化后對蛋白酶的耐受力有所提高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。可能的原因

49、是由于空間位阻效應(yīng)使蛋白酶不能進(jìn)入固定化酶內(nèi)部。,（3）酶學(xué)特性的變化 A、底物專一性：由于位阻效應(yīng)，對底物的專一性明顯下降。 B、最適pH：最適pH可能變大，也可能變??；pH-酶活曲線可能發(fā)生變化，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質(zhì)有關(guān)。帶負(fù)電荷的載體使pH偏大；帶正電荷的載體使之偏??；中性載體通常不改變最適pH。pH-酶活曲線與游離酶相比，或保持相同的鐘罩型、或變得更陡、或更平坦。,C、最適溫度：一般升高。原因是固定化后空間結(jié)構(gòu)

50、更為穩(wěn)定。有些酶不變或下降，如多空玻璃共價結(jié)合的葡萄糖異構(gòu)酶和亮氨酸氨肽酶的最適溫度與游離酶一樣。D、米氏常數(shù)（Km） ：Km值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會變小。當(dāng)?shù)孜餅榇蠓肿訒r，采用包埋法固定則Km增加較大；底物為小分子時， Km變化不大。E、最大反應(yīng)速度（Vm）：變化很小或不變。,,,3、固定化細(xì)胞的性質(zhì),細(xì)胞的固定化，需要采用適當(dāng)措施提高細(xì)胞膜的通透性來提高胞內(nèi)酶的活力和轉(zhuǎn)化效率。固定化細(xì)胞與固定化酶的性質(zhì)基

51、本相似。最適pH變化無特定規(guī)律最適溫度一般與游離細(xì)胞相同，但個別也會提高。穩(wěn)定性一般會提高，因此決定其工業(yè)的廣泛應(yīng)用。,（五）評價固定化酶（細(xì)胞）的指標(biāo),1、固定化酶活力測定單位時間內(nèi)，單位體積中的底物減少量或產(chǎn)物增加量表示。對底物或產(chǎn)物具有光吸收、旋光、電位差或熒光性質(zhì)的變化，可以直接測定。對不能通過底物或產(chǎn)物的變化量來測定其活力的反應(yīng)，可通過與其產(chǎn)物相偶聯(lián)的酶促反應(yīng)來測定活力。,根據(jù)固定化酶的反應(yīng)系統(tǒng)，活力測定可分為分批

52、測定和連續(xù)測定。分批測定：固定化酶在攪拌或震蕩情況下進(jìn)行，間隔一定時間取樣，過濾后按常規(guī)方法測定。測定結(jié)果與反應(yīng)器形狀、大小、反應(yīng)液數(shù)量、攪拌和震蕩速度有關(guān)。速度加快，活力增加，但增加到一定活力后會恒定；攪拌過快會導(dǎo)致固定化酶破碎，因此要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件。連續(xù)測定：引出反應(yīng)液到流動比色杯中進(jìn)行分光測定；或在連續(xù)流反應(yīng)器中，根據(jù)底物的流入速度和反應(yīng)速度之間的關(guān)系計算酶活力，此時注意反應(yīng)器形狀對反應(yīng)速度的影響。,影響酶活力測定的因素很多

53、，如測定環(huán)境、pH、溫度、離子強(qiáng)度、酶濃度、震蕩和攪拌速度以及固定化酶顆粒大小變化等，為確?？杀刃?，必須嚴(yán)格控制反應(yīng)條件的一致性。實際應(yīng)用中，測定條件應(yīng)盡可能與實際工藝條件相同。,2、偶聯(lián)率及相對活力的測定活力回收率=固定化酶總活力/加入酶的總活力相對活力＝固定化酶總活力/（加入酶的總活力－上清液中未偶聯(lián)的酶活力）偶聯(lián)率＝（加入酶活力－上清液酶活力）/加入蛋白活力 偶聯(lián)率=1，表示反應(yīng)控制好，固定化或擴(kuò)散限制引起的酶失

54、活不明顯；1時，有細(xì)胞分裂或從載體排除抑制劑等因素影響。,,3、半衰期，即酶的活力降為初活力一半時所經(jīng)歷的連續(xù)操作時間，用T1/2表示。4、熱穩(wěn)定性：將固定化酶在不同溫度下溫育1 h，在最適溫度下測酶活力，一般保持在60%以上。,（七）酶傳感器,（一）原理它將活性物質(zhì)酶覆蓋在電極表面，酶與被測的有機(jī)物或無機(jī)物反應(yīng)，形成一種能被電極響應(yīng)的物質(zhì)。1967年Updick和Hicks將固定化的葡萄糖氧化酶膜結(jié)合在氧電極上，做成了第一支葡萄

55、糖電極；此后，這類酶傳感器通常是通過檢測產(chǎn)物H2O2的濃度變化或氧的消耗量來檢測底物。,,,,,,用葡萄糖氧化酶電極測定血液、尿、發(fā)酵液中的葡萄糖濃度；用脲酶電極測定血液中的尿素濃度,酶傳感器主要類型,酶催化特定底物發(fā)生反應(yīng)，從而使特定生成物的量有所增減.用能把這類物質(zhì)的量的改變轉(zhuǎn)換為電信號的裝置和固定化酶耦合，即組成酶傳感器.依據(jù)信號轉(zhuǎn)換器的類型,酶傳感器大致可分為酶電極(主要包括離子選擇電極、氣敏電極、氧化還原電極等電化學(xué)電極)

56、、酶場效應(yīng)晶體管傳感器(FET-酶)和酶熱敏電阻傳感器等。,離子敏場效應(yīng)晶體管酶傳感器（ISFET）對離子或分子敏感的半導(dǎo)體器件ISFET與常用的絕緣柵型場效應(yīng)晶體管構(gòu)造相同．不過在輸入柵極做了一些改進(jìn)，以能與特定的化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)，產(chǎn)生電位的酶膜取代金屬極．讓酶膜直接與溶液接觸，由于酶膜對溶液中的離子有選擇作用，從而調(diào)制ISFET的漏電流變化，利用這個特性就能檢測一溶液中的離子活度．,第四節(jié) 固定化酶和固定化細(xì)胞的反應(yīng)器,固定化酶和固

57、定化細(xì)胞能否用于工業(yè)化生產(chǎn)，關(guān)鍵取決于酶反應(yīng)器的設(shè)計和選擇,1、什么是酶反應(yīng)器,2、酶反應(yīng)器類型及特點,3、酶反應(yīng)器的選擇,Go,Go,Go,99,1、什么是酶反應(yīng)器,迄今，人們已發(fā)明了把酶固定化的多種技術(shù)?？梢允姑概c之結(jié)合的固體材料，常用的有纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、高分子聚合物及多孔無機(jī)材料等等。人們把這些材料制成含有大量空隙的形態(tài)，使其具有較大的表面積。在一定的條件下，酶可以與這些材料以物理吸附、化學(xué)鍵形成或生物特異性結(jié)合等方式結(jié)

58、合，有時也可以是固體材料網(wǎng)絡(luò)把酶包起來。將這些結(jié)合了酶的載體材料裝填成柱或別的形式的反應(yīng)裝置，再配以進(jìn)出料及其他條件的控制設(shè)備，便成了一種新型的反應(yīng)器--固定化酶生物反應(yīng)器。,100,用于酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備稱為酶反應(yīng)器。,酶反應(yīng)器是根據(jù)酶的催化特性而設(shè)計的反應(yīng)設(shè)備。其設(shè)計的目標(biāo)就是生產(chǎn)效率高、成本低、耗能少、污染少，以獲得最好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。,酶反應(yīng)器是用于完成酶促反應(yīng)的核心裝置。它為酶催化反應(yīng)提供合適的場所和最佳的

59、反應(yīng)條件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。它處于酶催化應(yīng)過程的中心地位，是連接原料和產(chǎn)物的橋梁。,101,酶催化反應(yīng)過程示意圖,102,理想的酶反應(yīng)器要求,生物反應(yīng)器設(shè)計的主要目標(biāo)：使產(chǎn)品的質(zhì)量最高，生產(chǎn)成本最低。評價生物反應(yīng)器的主要標(biāo)準(zhǔn)：反應(yīng)器生產(chǎn)能力的大小和產(chǎn)品質(zhì)量的高低。,,(4) 應(yīng)具有最佳的無菌條件，否則，雜菌污染使反應(yīng)器的生產(chǎn)能力下降。,(1) 所用生物催化劑應(yīng)具有較高的比活和酶濃度（或細(xì)胞濃度）

60、，才能得到較大的產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率。,(2) 能用電腦自動檢測和調(diào)控，從而獲得最佳的反應(yīng)條件。,(3) 應(yīng)具有良好的傳質(zhì)和混合性能。傳質(zhì)是指底物和產(chǎn)物在反應(yīng)介質(zhì)中的傳遞。傳質(zhì)阻力是反應(yīng)器速度限制的主要因素。,103,2、酶反應(yīng)器類型及特點,酶反應(yīng)器的種類有常用于飲料和食品加工工業(yè)的攪拌罐型反應(yīng)器，使用最廣泛的固定化酶反應(yīng)器的固定床型反應(yīng)器，適合于生化反應(yīng)的膜式反應(yīng)器等。,104,常見的酶反應(yīng)器類型,按結(jié)構(gòu)區(qū)分?jǐn)嚢韫奘椒磻?yīng)器（Stirred T

61、ank Reactor, STR）鼓泡式反應(yīng)器(bubble column reactor, BCR )填充床式反應(yīng)器(packed column reactor, PCR )流化床式反應(yīng)器( Fluidized Bed Reactor, FBR)膜反應(yīng)器(Membrane Reactor, MR) 按操作方式區(qū)分分批式反應(yīng)(batch )連續(xù)式反應(yīng)(continuous )流加分批式反應(yīng)(feeding batch )

62、 按二者混合形式區(qū)分連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）分批攪拌罐反應(yīng)器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR）,105,(1)間歇式酶反應(yīng)器,又稱為批量反應(yīng)器（Batch Reactor BSTR）、間歇式攪拌罐、攪拌式反應(yīng)罐。其特點是：底物與酶一次性投入反應(yīng)器內(nèi)，產(chǎn)物一次性取出；反應(yīng)完成之后，固定化酶（細(xì)胞）用過濾法或超濾法回收，再轉(zhuǎn)入下一批

63、反應(yīng)。 優(yōu)點是：裝置較簡單，造價較低，傳質(zhì)阻力很小，反應(yīng)能很迅速達(dá)到穩(wěn)態(tài)。缺點是：操作麻煩，固定化酶經(jīng)反復(fù)回收使用時，易失去活性，故在工業(yè)生產(chǎn)中，間歇式酶反應(yīng)器很少用于固定化酶，但常用于游離酶。,106,(2)連續(xù)式酶反應(yīng)器,又稱為連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）、連續(xù)式攪拌罐。向反應(yīng)器投入固定化酶和底物溶液，不斷攪拌，反應(yīng)達(dá)到平衡之后，再以恒定的流速連續(xù)流入底物

64、溶液，同時，以相同流速輸出反應(yīng)液（含產(chǎn)物）。與BSTR的區(qū)別：連續(xù)進(jìn)料、連續(xù)出料。優(yōu)點是：在理想狀況下，混合良好，各部分組成相同，并與輸出成分一致。缺點是：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損固定化酶顆粒。,底物溶液進(jìn)口,反應(yīng)液出口,107,(3)填充床反應(yīng)器,填充床反應(yīng)器（Packed Reactor,PBR）,又稱固定床反應(yīng)器。將固定化酶填充于反應(yīng)器內(nèi)，制成穩(wěn)定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反應(yīng)條件下實現(xiàn)酶催化反應(yīng)，以一定的流速，

65、收集輸出的轉(zhuǎn)化液（含產(chǎn)物）。優(yōu)點是：高效率、易操作、結(jié)構(gòu)簡單等，因而，PBR是目前工業(yè)生產(chǎn)及研究中應(yīng)用最為普遍的反應(yīng)器。它適用于各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液，以及有產(chǎn)物抑制的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。缺點是：傳質(zhì)系數(shù)和傳熱系數(shù)相對較低。當(dāng)?shù)孜锶芏群腆w顆粒或黏度很大時，不宜采用PBR。,108,(4)流化床反應(yīng)器,流化床反應(yīng)器（Fluidized Bed Reactor, FBR）。特點是：底物溶液以足夠大的流速，從反應(yīng)器

66、底部向上通過固定化酶柱床時，便能使固定化酶顆粒始終處于流化狀態(tài)。其流動方式使反應(yīng)液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之間。FBR可用于處理黏度較大和含有固體顆粒的底物溶度，同時，亦可用于需要供氣體或排放氣體的酶反應(yīng)（即固、液、氣三相反應(yīng)）。因FBR混合均勻，故不適用于有產(chǎn)物抑制的酶反應(yīng)。,109,(5)鼓泡式反應(yīng)器,鼓泡式反應(yīng)器(bubble column reactor, BCR)是利用從反應(yīng)器底部通入的氣體產(chǎn)生的大

67、量氣泡，在上升過程中起到提供反應(yīng)底物和混合兩種作用的一類反應(yīng)器。也是一種無攪拌裝置的反應(yīng)器。鼓泡式反應(yīng)器可以用于游離酶和固定化酶的催化反應(yīng)。在使用鼓泡式反應(yīng)器進(jìn)行固定化酶的催化反應(yīng)時，反應(yīng)系統(tǒng)中存在固、液、氣三相，又稱為三相流化床式反應(yīng)器。鼓泡式反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)簡單，操作容易, 剪切力小，物質(zhì)與熱量的傳遞效率高，是有氣體參與的酶催化反應(yīng)中常用的一種反應(yīng)器。例如氧化酶催化反應(yīng)需要供給氧氣，羧化酶的催化反應(yīng)需要供給二氧化碳等。,110,

68、(6)膜反應(yīng)器,膜反應(yīng)器（membrane reactor, MR）是將酶催化反應(yīng)與半透膜的分離作用組合在一起而成的反應(yīng)器?？梢杂糜谟坞x酶的催化反應(yīng)，也可以用于固定化酶的催化反應(yīng)。用于固定化酶催化反應(yīng)的膜反應(yīng)器是將酶固定在具有一定孔徑的多孔薄膜中，而制成的一種生物反應(yīng)器。膜反應(yīng)器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纖維型、轉(zhuǎn)盤型等多種形狀。常用的是中空纖維反應(yīng)器。,111,簡稱CSTR-UFR。在CSTR（連續(xù)式攪拌罐）出口處設(shè)置一個