南京農(nóng)業(yè)大學(xué)考研生物化學(xué)課件

1、一、生物化學(xué)概述,（一）生物化學(xué)研究的基本內(nèi)容（二）生物化學(xué)的發(fā)展簡史,1、闡明三羧酸循環(huán)的科學(xué)家是　 A. J.D.Watson B. H.A.KrebsC.L. C. Pauling D. J.B.Sumner (2008)2、世界上首次人工合成具有生物活性酵母tRNAAla 的國家是： A 美國 B

2、 中國 C 英國 D 法國 (2009),第1章 蛋白質(zhì)化學(xué),本章主要內(nèi)容,蛋白質(zhì)在生命活動中的重要作用 蛋白質(zhì)的組成單位——氨基酸 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分離與純化,,1.蛋白質(zhì)在生命活動中的重要作用,由氨基酸（AA）之間以肽鍵相連而成的多肽鏈，經(jīng)折疊彎曲形成的具有一定的空間構(gòu)象和生物學(xué)功能的高分子化合物，又簡稱為功能大分子,1.1 蛋白質(zhì)的概念,,1.蛋白質(zhì)在生命活動中的

3、重要作用,,生物催化作用： 酶 運輸作用：如血紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白 調(diào)節(jié)作用：如胰島素、生長激素 運動作用：如肌動蛋白和肌球蛋白 防御功能：如免疫球蛋白、凝血因子 營養(yǎng)功能：如卵清蛋白、酪蛋白 結(jié)構(gòu)蛋白：如膠原蛋白、角蛋白 能量轉(zhuǎn)換蛋白：如細胞色素 基因調(diào)節(jié)蛋白：如阻遏蛋白,1.2 蛋白質(zhì)在機體內(nèi)的生物學(xué)功能,,按形狀可將蛋白質(zhì)分為： 纖維狀蛋白質(zhì)：多為結(jié)構(gòu)蛋白。 球狀蛋白質(zhì)： 具有廣泛的

4、生物學(xué)功能。如酶、蛋白類激素等。按結(jié)構(gòu)和功能可將蛋白質(zhì)分為： 簡單蛋白（simple protein）：僅有蛋白質(zhì)組成的、結(jié)構(gòu)簡單的蛋白質(zhì)。 結(jié)合蛋白（conjugated protein）：在蛋白質(zhì)分子中除了含有氨基酸成分外，還要有其他的成分的存在，才能保證其正常生物活性的蛋白質(zhì)。 分子中包含蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分。,1.3 蛋白質(zhì)的分類,,2.蛋白質(zhì)的化學(xué)組成,2.1 蛋白質(zhì)的元素組成,所有蛋白質(zhì)均含有

5、： C 50%-55% H 6%-8% O 20%-23% N 15%-17%某些蛋白質(zhì)含有： S 0.3%-2.5% 以及P少數(shù)蛋白質(zhì)含有：Fe, Cu，Zn，Mo和I等元素,蛋白質(zhì)中N的平均含量約16%，因此食物與飼料中蛋白質(zhì)的含量可以通過凱氏定氮進行大致估計。,請寫出凱氏定氮法測定

6、蛋白質(zhì)含量的基本原理，并簡單說明在蛋白樣品中加入一定量的三聚氰胺（分子式C3H6N6）為什么會導(dǎo)致樣品測定值高于實際值的原因。（9分）,凱氏定氮法是測定蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法，該方法的原理是將待測物質(zhì)（如奶粉）在硫酸銅催化下，用濃硫酸消化分解為透明溶液，使各種形態(tài)的含氮化合物（蛋白質(zhì)、氨基酸等）全部轉(zhuǎn)化為銨離子（NH4+）形態(tài)，再采用經(jīng)典的酸堿滴定法測出氮含量，再乘以一定換算系數(shù)即為蛋白質(zhì)含量。這個方法是通過測定樣品中的含氮量來推算蛋白質(zhì)

7、含量的。一般認為蛋白質(zhì)中的平均含氮量為16%，于是含氮量=蛋白質(zhì)量×16%，蛋白質(zhì)量=含氮量/16%=含氮量×6.25 。 三聚氰胺是一種重要的化工原料，從分子式可以算出它的含氮量高達66.7%，用凱氏定氮法測牛奶和其他食品中的蛋白質(zhì)數(shù)值時，根本不會區(qū)分這種偽蛋白氮。所以加入少許三聚氰胺能顯著提高奶粉等食品中的氮含量，導(dǎo)致樣品測定值高于實際值，使偽劣產(chǎn)品得以堂而皇之的通過正規(guī)渠道流入市場。,,2.2 蛋白質(zhì)

8、的基本結(jié)構(gòu)單位——氨基酸,2.2.1 氨基酸的基本結(jié)構(gòu)和構(gòu)型 存在于自然界的氨基酸有300種。動物機體的蛋白質(zhì)經(jīng)強酸水解之后可以得到20種氨基酸，并且均為L-氨基酸（除了甘氨酸），含不對稱的α-碳原子。它們之間的差別在于有不同的側(cè)鏈基團 R。,氨基酸的結(jié)構(gòu)通式,,氨基酸與甘油醛的構(gòu)型,,非極性氨基酸（8）——疏水性氨基酸,極性氨基酸（親水性氨基酸）,,非解離的極性氨基酸(不帶電7)酸性氨基酸（帶負電2）堿

9、性氨基酸(帶正電3),2.2.2 組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸,非極性R基氨基酸 丙氨酸 Ala(A) 纈氨酸 Val (V) 亮氨酸 Leu (L) 異亮氨酸 Ile (I) 脯氨酸 Pro (P) 苯丙氨酸Phe(F) 色氨酸 Trp(W) 甲硫氨酸 Met(M)不帶電荷的極性R基氨基酸 甘氨酸 Gly (G)

10、 絲氨酸 Ser (S) 蘇氨酸 Thr (T) 半胱氨酸 Cys (C) 酪氨酸 Tyr (Y) 天冬酰胺 Asn (N) 谷氨酰胺 Gln (Q)酸性氨基酸 天冬氨酸 Asp(D) 谷氨酸 Glu(E)堿性氨基酸 賴氨酸 Lys(K) 精氨酸 Arg(R) 組氨酸 His(H),I 非極性氨基酸,I 非極性氨

11、基酸,脯氨酸Pro (P),,COOH,,C,,,H,NH,,CH2,CH2,CH2,,,,,苯丙氨酸Phe(F),COOH,,C,,,H,NH2,,CH2,,COOH,CH2,,C,,,H,NH2,,,色氨酸Trp(W),,,,NH,,,蛋氨酸 Met(M)甲硫氨酸,COOH,,C,,,H,NH2,,CH2,CH2,S,,,,CH3,,,II 不帶電荷的極性氨基酸,甘氨酸Gly (G),,COOH,,C,,,H,

12、NH2,,H,CH,COOH,,C,,,H,NH2,,,蘇氨酸Thr (T),,CH3,HO,,,絲氨酸Ser (S),COOH,,C,,,H,NH2,,CH2,HO,,半胱氨酸Cys (C),COOH,C,,,H,NH2,,,,CH2,,HS,,II 不帶電荷的極性氨基酸,,酪氨酸 Tyr (Y),,COOH,,C,,,H,NH2,,CH2,,HO,,,天冬酰胺 Asn (N),COOH,,C,,,H,NH2,,CH2

13、,C,,O,H2N,,COOH,,C,,,H,NH2,,,谷氨酰胺 Gln (Q),CH2,C,,O,H2N,,CH2,,III 酸性氨基酸,IV 堿性氨基酸,,( CH2)4,賴氨酸 Lys (K),,COOH,C,,,H,NH2,,H2N,,,精氨酸 Arg (R),COOH,,C,,,H,NH2,,( CH2)3,NH,,C,,NH,H2N,,COOH,,C,,,H,NH2,,,組氨酸 His (H),CH2,,,

14、N,,,HN,,,,,,,,,氨基酸分類 （1）根據(jù)R基團的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分類:結(jié)構(gòu)特點：芳香族、雜環(huán)族等氨基酸、帶苯環(huán)的、有羥基的、含S的等等性質(zhì)特點：疏水性（非極性）、親水性（極性）氨基酸，酸性、堿性等氨基酸 （2）叢營養(yǎng)學(xué)角度分類: 必需氨基酸、非必需氨基酸 P40,1、編碼氨基酸 2、非編碼氨基酸 3、非蛋白質(zhì)氨基酸,2.2.3 氨基酸的分類,編碼氨基酸,,非編碼氨基酸,沒有相應(yīng)的三聯(lián)體遺傳密碼。由編碼

15、氨基酸經(jīng)羥基化、甲基化、磷酸化等修飾形成的衍生物。 例如：膠原蛋白和彈性蛋白中的 4-羥脯氨酸 、5-羥賴氨酸等。 P39,非蛋白質(zhì)氨基酸,在生物體內(nèi)，還發(fā)現(xiàn)150多種不參與蛋白質(zhì)組成的氨基酸。 這些非蛋白質(zhì)氨基酸多是重要的代謝物前體或代謝中間產(chǎn)物。 P39,,2.2.4 氨基酸的主要理化性質(zhì),,各種氨基酸在可見區(qū)都沒有光吸收。 在紫外光區(qū)芳香族氨基酸在280nm處有最大吸收峰（色氨

16、酸、酪氨酸、苯丙氨酸的最大吸收波長分別為279、278、259nm ）,光吸收特性,,氨基酸的兩性解離,氨基酸分子在水溶液中呈兩性離子狀態(tài)，在其等電點時，氨基酸所帶的正、負電荷相等，凈電荷為零。,,氨基酸的等電點,對某一種氨基酸而言，當溶液在某一個特定的pH，氨基酸以兩性離子的形式存在，并且其所帶的正電荷數(shù)與負電荷數(shù)相等，即凈電荷為零。在直流電場中，它既不向正極，也不向負極移動。此時溶液的pH稱為這種氨基酸的等電點（pI）。

17、例如，甘氨酸的羧基的pK1為2.34，氨基的pK2為9.60，其pI為5.97。,20種氨基酸的pI,等電點的計算,pI = 1/2 ( pK1' + pK2' ),中性氨基酸,pI = 1/2 ( pK2' + pKR' ),pI = 1/2 ( pK1' + pKR' ),堿性氨基酸,酸性氨基酸,,例 Gly 的pI 計算,pI = 1/2 ( pK1' + pK2'

18、),例 Lys 的pI 計算,pI = 1/2 ( pK2' + pKR' ),溶液 pH 值增大,,,,Glu 的解離,pH > pI 帶負電，移向正極,pH < pI 帶正電，移向負極,pH = pI 不帶電，不移動,重要的化學(xué)性質(zhì),a,茚三酮反應(yīng),反應(yīng)分2步：,茚三酮反應(yīng)常用于aa的定性和定量分析,還原性茚三酮,水合茚三酮,紙層析分開各種氨基酸后定性定量分析,重要的化學(xué)性質(zhì),茚三酮反應(yīng),在酸性條件

19、下，氨基酸與茚三酮共熱，生成紫色化合物,注意: 若是亞氨基酸，生成黃色化合物,重要的化學(xué)性質(zhì),b, Sanger反應(yīng),在弱堿溶液中，氨基酸的α-氨基與2,4-二硝基氟苯(DNFB) 反應(yīng)，生成黃色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）。,此反應(yīng)最初被Sanger 用于測定肽鏈 N-端氨基酸,重要的化學(xué)性質(zhì),c, Edman反應(yīng),＋,可用層析法鑒定出aa的種類,重要的化學(xué)性質(zhì),Edman反應(yīng),此反應(yīng)即是目前“蛋白質(zhì)順序測定”的設(shè)計原理,,

20、3.蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu),3.1 肽鍵（peptide bond）和肽（peptide ）,肽鍵：指蛋白質(zhì)分子中，由一個氨基酸的α-COOH和另一個氨基酸的α-NH2之間脫水縮合而成的酰胺鍵，它是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的主要共價鍵。,,肽由氨基酸通過肽鍵形成的聚合物（二肽、三肽、寡肽、…多肽）,多肽（polypeptide）和多肽鏈（polypeptide chain）,,在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸序列

21、，多肽鏈上不完整的氨基酸，稱為氨基酸殘基(amino acid residue) 上圖為： 絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸,（N-端）,（C-端）,,3.2 肽單位平面與二面角,,肽平面（peptide plane）：肽鏈主鏈的肽鍵C-N具有雙鍵的性質(zhì)， 因而不能自由的旋轉(zhuǎn)，使連接在肽鍵上的六個原子共處于一個平面上，此平面稱為肽單位平面，又稱酰胺平面。,二面角（dihedral angle）,肽平面

22、1 圍繞 Cα2—N1 單鍵旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)的角度用Φ表示； 肽平面2 也可以圍繞 Cα2—C2 單鍵旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)的角度用Ψ表示。,N1,C α 2,C2,肽的性質(zhì),茚三酮反應(yīng),（2）化學(xué)性質(zhì),Sanger反應(yīng) 氨基酸也有,Edman 反應(yīng),雙縮脲反應(yīng)——肽和蛋白所特有的，氨基 酸不發(fā)生雙縮脲反應(yīng),,,,（1）兩性性質(zhì),γ—谷氨酰半胱氨酰甘氨酸Cys 殘基上的-SH是GSH的活性

23、基團。,1、谷胱甘肽（GSH）：由Glu-Cys-Gly組成的三肽,,,,重要的天然寡肽,谷胱甘肽在生物體內(nèi)的功能,短桿菌肽 S,環(huán)10肽,短桿菌肽 S 為一種抗菌素。還有一些抗菌素，如放線菌素、多粘菌素等也是肽或肽衍生物。,,3.3 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),,一級結(jié)構(gòu)（primary structure）：即蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是指多肽鏈上各種氨基酸殘基的種類和排列順序，也包括二硫鍵的數(shù)目。,,牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)： 51個氨基酸，A（21

24、肽）、B（30肽）兩條肽鏈，A鏈內(nèi)一對S-S，A和B鏈間2對S-S,,3.4 蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu),,指一條或數(shù)條多肽鏈上所有原子和基團在三維空間上的排布，即構(gòu)象（conformation）或空間結(jié)構(gòu)。 構(gòu)象由單鍵旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的各種立體結(jié)構(gòu) 構(gòu)型（configuration ）是通過改變共價鍵形成的結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)由明顯的結(jié)構(gòu)層次。 一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。,,維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中重要的化學(xué)鍵,蛋白質(zhì)分

25、子中的共價鍵與次級鍵,,3.4.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次,,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，但具有明顯的結(jié)構(gòu)層次一級結(jié)構(gòu)（多肽鏈上的氨基酸排列順序）二級結(jié)構(gòu)（多肽鏈主鏈骨架的局部空間結(jié)構(gòu)）超二級結(jié)構(gòu)（二級結(jié)構(gòu)單位的集合體）結(jié)構(gòu)域（多肽鏈上可以明顯區(qū)分的球狀區(qū)域）三級結(jié)構(gòu)（多肽鏈上所有原子和基團的空間排布）四級結(jié)構(gòu)（由球狀亞基或分子締合而成的集合體）,,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次,,3.4.2 二級結(jié)構(gòu),,,二級結(jié)構(gòu)（secondary struct

26、ure）：指多肽鏈主鏈在一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步的盤旋或折疊，形成的周期性構(gòu)象，維系二級結(jié)構(gòu)的力是氫鍵。,二級結(jié)構(gòu)主要形式有：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲,,,α-螺旋（ α-helix）,是在角蛋白中最常見的構(gòu)象，為右手螺旋。每圈螺旋3.6個氨基酸殘基。側(cè)鏈基團R在螺旋外側(cè)。,1） α-螺旋結(jié)構(gòu)參數(shù) 螺距=0.54nm/圈 3.6個AA/圈 100°/AA 0.15nm/

27、AA,α-螺旋結(jié)構(gòu)的主要特點：,蛋白質(zhì)中最常見、含量最豐富的二級結(jié)構(gòu),2）絕大多數(shù)天然蛋白質(zhì)α-螺旋都是右手螺旋。每個氨基酸殘基的N-H都與前面第四個殘基C=O形成氫鍵。α-螺旋也稱3.613-螺旋,3）肽鏈上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成，氫鍵幾乎平行于中心軸; 螺旋體中所有氨基酸殘基側(cè)鏈（R-基團）都伸向外側(cè),* R為Gly時，由于Ca上有2個氫，使Ca-C、Ca-N的轉(zhuǎn)動的自由度很大，即剛性很小，所以使螺旋的穩(wěn)定性大大降低；而多

28、聚亮氨酸側(cè)鏈R基較大，產(chǎn)生空間位阻，影響螺旋形成,* α-螺旋遇到Pro就會被中斷而拐彎，因為脯氨酸是亞氨基酸。,* 帶相同電荷的氨基酸殘基連續(xù)出現(xiàn)在肽鏈上時，螺旋的穩(wěn)定性降低。,4)螺旋穩(wěn)定性由氨基酸序列決定,,,β-折疊（ β-sheet）,平行結(jié)構(gòu),反平行結(jié)構(gòu),存在于絲心蛋白、角蛋白。呈平行的和反平行的比較伸展的構(gòu)象。主鏈之間形成H鍵，側(cè)鏈基團R交替地位于片層的上、下。,,,β-轉(zhuǎn)角（ β-turn）,,肽鏈1800

29、的回折,無規(guī)卷曲（random coil）,兩種主要類型的β-轉(zhuǎn)角,指蛋白質(zhì)的肽鏈中沒有確定規(guī)律性的那部分肽段構(gòu)象。,,3.4.3 超二級結(jié)構(gòu),,,超二級結(jié)構(gòu)（super secondary structure）：在蛋白質(zhì)中經(jīng)常存在由若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元按一定規(guī)律組合在一起，形成有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)集合體，超二級結(jié)構(gòu)又稱模體（motif）。,,四種類型的超二級結(jié)構(gòu),,3.4.4 結(jié)構(gòu)域,,,結(jié)構(gòu)域（domain）：在較大的蛋白質(zhì)分子里

30、，多肽鏈的空間折疊常常形成兩個或多個近似球狀的三維實體,它們之間由舒展的肽鏈連接。,由β-折疊、 α-螺旋形成的結(jié)構(gòu)域,丙酮酸激酶的一個結(jié)構(gòu)域,免疫球蛋白的一個結(jié)構(gòu)域,,,3.4.5 三級結(jié)構(gòu),,三級結(jié)構(gòu)（tertiary structure）：指一條多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)（超二級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域）的基礎(chǔ)上，進一步盤繞、折疊而成的具有特定肽鏈走向的緊密球狀結(jié)構(gòu), 或者說三級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中所有原子和基團在三維空間的排布。,,肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)及

31、其結(jié)合的血紅素亞基,三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要靠非共價相互作用，氨基酸親水的基團傾向于分布在分子的表面，疏水的基團在分子的內(nèi)部。,,3.4.6 四級結(jié)構(gòu),,四級結(jié)構(gòu)（quaternary structure）：多個具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈（稱亞基，Subunit）的聚合。或者說，四級結(jié)構(gòu)指亞基的種類、數(shù)目及各個亞基在寡聚蛋白中的空間排布和亞基之間的相互作用。,,血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu),四級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要靠是疏水作用力，另外還有離子鍵、氫鍵、范德華引力

32、等。 血紅蛋白由4個亞基組成（α2β2），每個亞基都與肌紅蛋白非常相似。,,,4.多肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,,,,4.1 一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,氨基酸組成變化改變其功能,,一級結(jié)構(gòu)改變引起分子病,基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物功能的下降或喪失，就會產(chǎn)生疾病，這種病稱為分子?。╩olecular disease）。,最早從分子水平證明的先天性遺傳病——鐮刀形紅細胞貧血癥(sickle-cell anemi

33、a)。,鐮刀形紅細胞,正常血細胞,鐮刀型紅細胞貧血病 (sickle-cell anemia),β-鏈 1 2 3 4 5 6 7 8Hb-A H2N- Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-S H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Va

34、l-Glu-Lys…,hemoglobin GAA(Glu) -> GTA(Val),,Val 取代Glu,O2,O2,,不同生物與人的細胞色素C相比較AA差異數(shù)目 黑猩猩 0 雞、火雞 13 牛豬羊 10 海龜 15 狗驢 11 小麥 35 粗糙鏈孢霉

35、43 酵母菌 44親緣關(guān)系越近，AA順序的相似性越大。,一級結(jié)構(gòu)變異與分子進化,CytC 高級結(jié)構(gòu)的保守性,盡管不同生物間親緣關(guān)系差別很大，但與細胞色素C功能密切相關(guān)的AA順序卻有共同之處,不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)，它們的氨基酸序列有明顯的相似性，有明顯序列相似性的蛋白質(zhì)，稱為同源蛋白質(zhì)。,不變殘基----同源蛋白質(zhì)完全相同的氨基酸殘基，決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能?？勺儦埢?---有相當大

36、變化的氨基酸殘基，體現(xiàn)了種屬特異性。,可變殘基與生物進化有關(guān)，親緣關(guān)系越近，可變殘基越相似，說明蛋白質(zhì)的進化反應(yīng)了生物進化,,,,蛋白質(zhì)前體的激活,,,一些蛋白質(zhì)或酶在細胞中首先合成(翻譯)的是其前體,在成為有功能的蛋白質(zhì)或酶之前需要激活. 例如,胰島素(insulin ).的前體是胰島素原(proinsulin),要在切除C肽之后才轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘囊葝u素,胰島素原的一級結(jié)構(gòu),,,,,4.2 高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性

37、,,,變性（denaturation）是指一些理化因素，如熱、光、機械力、酸堿、有機溶劑、重金屬離子、變性劑（如尿素等），破壞了維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的非共價作用力，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，結(jié)果導(dǎo)致其生物活性的喪失。變性一般并不引起肽鍵的斷裂，但蛋白質(zhì)的溶解度可能降低，可能凝固和沉淀。 變性有時是可逆的。消除變性的因素，有些蛋白質(zhì)的生物活性可能得以恢復(fù)，稱為復(fù)性（renaturation）。,,,,,,核糖核酸酶RNase的變性與復(fù)性

38、,,,,,,瘋牛病病牛的海綿樣腦組織,瘋牛病(BSE)可能是由于朊蛋白（Pron protein，PrP）的錯誤折疊引起的,朊病毒與蛋白質(zhì)構(gòu)象病,正常朊病毒蛋白與朊病毒空間結(jié)構(gòu)的差異 朊病毒本身不能復(fù)制，但它卻可以攻擊大腦的正常朊病毒蛋白，使其發(fā)生構(gòu)象改變，并與其結(jié)合，成為致病的朊病毒二聚體。此二聚體再攻擊正常的朊病毒蛋白。這樣，腦組織中的朊病毒不斷積蓄，造成腦組織發(fā)生退行性變。,正常朊病毒蛋白結(jié)構(gòu)

39、（顯示?-螺旋）,朊病毒結(jié)構(gòu)（顯示?-片層結(jié)構(gòu)）,,,,蛋白質(zhì)的變構(gòu)與血紅蛋白的輸氧功能,,,變構(gòu)作用（Allosteric effect ）是指效應(yīng)劑（變構(gòu)劑）作用于多亞基的蛋白質(zhì)或酶的某個亞基后，導(dǎo)致其構(gòu)象改變，繼而引起其他亞基構(gòu)象的改變，結(jié)果引起蛋白質(zhì)或酶的生物活性發(fā)生變化。有的結(jié)果是變構(gòu)激活，有的則是變構(gòu)抑制。 例如，在血紅蛋白中，其4個亞基與氧分子的親和性不同。氧分子與血紅蛋白的一個亞基結(jié)合（比較難）后，引起其構(gòu)象發(fā)

40、生改變，這種變化在亞基之間傳遞，從而改變了其他亞基與氧的結(jié)合能力，使它們與氧的結(jié)合變得容易。其動力學(xué)曲線呈S型。,,,,,,氧合可以引發(fā)維系血紅蛋白4個亞基的8對離子鍵相繼斷開，從比較緊湊的T構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楸容^松弛的R構(gòu)象。,,,,,,,血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線,與肌紅蛋白相比，血紅蛋白的多個亞基之間的相互作用使其與氧的結(jié)合能力總體上削弱了（氧合曲線右移,由雙曲線轉(zhuǎn)變成S形曲線），但是賦予了其新的能力—— 可以容易地將其結(jié)合的氧從氧

41、分壓高的組織（肺泡）向氧分壓低的組織（肌肉）輸送和轉(zhuǎn)移。,,,,蛋白質(zhì)的正確折疊與分子伴侶,,,多肽鏈的特定空間結(jié)構(gòu)是其功能的保證。肽鏈的正確折疊或者亞基的裝配常常需要由一些蛋白質(zhì)，例如熱激蛋白（Heat shock protein , Hsp）和某些酶的幫助，并且消耗ATP。但是，這樣的蛋白質(zhì)與酶并不加入到最終的折疊產(chǎn)物或裝配復(fù)合物中。它們被稱為分子伴侶（molecular chaperone）。,1. 蛋白質(zhì)的酸堿性與等電點,

42、,酸堿性： α－氨基與α－羧基；側(cè)鏈基團如ε－氨基、 β－或γ－羧基、咪唑基、巰基等。可用電泳技術(shù)研究。,等電點：PI時蛋白質(zhì)溶解度最小。,5.蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) P65,2.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)（1）膠體溶液性質(zhì)： 布朗運動、電泳現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附能力等。（2）蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性及意義： 水化膜與帶有相同電荷；（3）透析法： 分離的分子量雜質(zhì)與蛋白質(zhì)。（4）沉淀反應(yīng),3 沉淀反應(yīng)

43、：a.中性鹽沉淀反應(yīng):鹽濃度不同可產(chǎn)生不同的反應(yīng)－－鹽溶與鹽析現(xiàn)象；分級沉淀；鹽析法得到的蛋白質(zhì)不變性。b.有機溶劑沉淀反應(yīng)：與水互溶的有機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等。注意容易引起蛋白質(zhì)變性。c.重金屬鹽沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)帶負電時，可與重金屬離子（Cu、Hg、Pb、Ag）結(jié)合成不溶性的蛋白鹽而沉淀。d.生物堿試劑的沉淀反應(yīng)：生物堿試劑如單寧酸、苦味酸等。,4. 蛋白質(zhì)的變性（1）定義：當?shù)鞍踪|(zhì)受到物理、化學(xué)因素影響后，分子的三維結(jié)

44、構(gòu)發(fā)生改變，而一級結(jié)構(gòu)并沒有破壞，此時蛋白質(zhì)失去了原有的生物活性，并伴隨著物理、化學(xué)性質(zhì)的改變。分為可逆與不可逆變性。（2）變性蛋白性質(zhì)的改變： 生物活性喪失 一些側(cè)鏈基團暴露 某些理化性質(zhì)改變 生物化學(xué)性質(zhì)改變（3）變性與沉淀（4）復(fù)性,5.蛋白質(zhì)呈色反應(yīng),,,,,5.2 蛋白質(zhì)的分離純化,,,（1）材料來源 來源方便、含量豐富、容易提取、 防止

45、變性（2）分離的一般原則 利用分子大小，如分子篩凝膠過濾； 利用電離性質(zhì)，如電泳； 利用溶解性，如等電點； 利用生物學(xué)特性，如親和層析等,,,,,,（3）純化鑒定 氨基酸組成分析、末端分析、 色譜分析、電泳分析、等電聚 焦分析、免疫化學(xué)分析 （4）序列測定 確定肽鏈的氨基酸組成、末端和S-S鍵數(shù)目 專一地酶解大的多肽成為較小的片

46、段 蛋白質(zhì)序列儀 應(yīng)用肽段序列重疊法確定氨基酸的排序 確定S-S鍵的位置,蛋白質(zhì)組學(xué)P72,一、蛋白質(zhì)的概念和生物學(xué)意義二、氨基酸1、氨基酸的基本結(jié)構(gòu)和性質(zhì)2、根據(jù)R基團極性對20種蛋白質(zhì)氨基酸的分類及三字符縮寫三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能1、肽的概念及理化性質(zhì)2、蛋白質(zhì)的初級結(jié)構(gòu)3、蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)（二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)）4、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,四、

47、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)1、蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量2、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點3、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 4、蛋白質(zhì)的紫外吸收特征5、蛋白質(zhì)的變性及復(fù)性五、蛋白質(zhì)的分離與純化1、蛋白質(zhì)的抽提原理及方法2、蛋白質(zhì)分離與純化的主要方法：電泳、層析和離心3、蛋白質(zhì)的定量方法,,1，下列氨基酸中，[a]TD=0的是: A Gln B Glu C Gly D Ile (2009)2，由360個氨基酸殘基形成

48、的典型α螺旋，其螺旋長度是　　 A.54nm B.36nm C.34nm D.15nm (2008),簡述蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)及其與生物進化的關(guān)系。(2008),,請寫出凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的基本原理，并簡單說明在蛋白樣品中加入一定量的三聚氰胺（分子式C3H6N6）為什么會導(dǎo)致樣品測定值高于實際值的原因。（9分）,1. 蛋白質(zhì)在波長為 nm的紫外光中有明顯的吸收峰，這是由 、

49、 和 三種氨基酸殘基所引起的。 2. Glu的pK1(a-COOH)=2.19、pK2(R基團)=4.25、pK3(a-NH3+) = 9.67，該氨基酸的pI值為 。3. 有一混合蛋白樣品，含A、B、C、D四種蛋白質(zhì)，其pI分別為4.9、5.2、6.6和7.8，若將此樣品液置于pH7.0的緩沖液中電泳，向陰極移動的有 。,4. 在組成蛋白質(zhì)的二十種氨基酸中， 是亞

50、氨基酸，當它在a-螺旋行進中出現(xiàn)時，可使螺旋 。5. Lys的a-COOH、a-NH3+ 的pK值分別為2.18和8.95，該氨基酸的pI值為9.74，則R基團的pK值為 ，它是由 基團的解離引起的。,6,   某蛋白質(zhì)的某一區(qū)段含有15個氨基酸殘基，這些殘基之間均可形成如下圖所示的氫鍵。(1) 該區(qū)段具有 的二級結(jié)構(gòu)，它的長度為

51、 納米。(2) 該區(qū)段的主鏈中可形成 個氫鍵。(3) 已知該區(qū)段被包埋在整個蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部，則這一區(qū)段很可能含有較多的 氨基酸。,,二、 選擇題1. 在下列肽鏈主干原子排列中，哪個符合肽鍵的結(jié)構(gòu)(A)C－N－N－C (B)C－C－C－N (C)N－C－C－C(D)C－C－N－C (E)C－O－C－N2. 下列什么氨基酸溶液不使偏振光發(fā)生旋轉(zhuǎn)(A)Ala

52、 (B)Gly (C)Leu (D)Ser (E)Val 3. 下列AA中，蛋白質(zhì)內(nèi)所沒有的是 (A)高半胱氨酸 (B)半胱氨酸 (C)鳥氨酸 (D瓜氨酸4. 蛋白質(zhì)變性不包括 (A) 肽鏈斷裂 (B) 離子鍵斷裂 (C) 疏水鍵斷裂 (D) 氫鍵斷裂,5. 下列氨基酸中，在波長280 nm處紫外吸收值最高的氨基酸是 (A) Lys (B)

53、Cys (C) Thr (D) Trp6. 維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的作用力是肽鍵 (B) 離子鍵 (C) 疏水鍵 (D) 氫鍵 (E) 二硫鍵 7. 蛋白質(zhì)肽鏈在形成?-螺旋時，遇到Pro殘基時，?-螺旋就會中斷而拐彎，主要是因為，(A) 沒有多余的氫形成氫鍵 (B) 不能形成所需的?角 (C) R基團電荷不合適 (D) 整個?-螺旋不穩(wěn)定,8.蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象主要取決于下列哪項（） A.多肽鏈

54、中的氨基酸排列順序B.次級鍵 C.鏈內(nèi)及鏈間的二硫鍵D.溫度及pH9.加入哪種試劑不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性（） A. 尿素 B.鹽酸胍 C.SDS D.硫酸銨 E.二氧化汞10.下列哪種氨基酸在生理pH范圍內(nèi)具有緩沖能力（） A.賴氨酸B.谷氨酸C.絲氨酸D.組氨酸E.蘇氨酸,有一混合液含有五種多肽（P

55、1、P2、P3、P4和P5），在pH8.0的條件下進行電泳分離，已知這五種多肽的PI 分別是P1為8.8，P2為5.5，P3為10.5，P4為7.3，P5為6.3，并且它們的相對分子質(zhì)量都大約為1000，問：1, 什么是多肽的PI，其大小和什么有關(guān)？2，若電泳染色結(jié)果如下圖所示，請在圖上1、2、3、4、5處標出每條帶所對應(yīng)的多肽。3，另有一多肽（P6），PI為10.5，相對分子質(zhì)量約為500，P6若與上述五種多肽在pH8.0一起

56、電泳，請指出它在電泳結(jié)束后的大概位置。 起點 1 2 3 4 5,,從蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)可預(yù)測它的高級結(jié)構(gòu)。下面是一段肽鏈的氨基酸排列順序：“Leu-Ala-His-Thr-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gln-Ala-Ala-Met-Cys-Lys-Trp-Glu-Ala-Gln-Pro

57、-Asp-Gly-Met-Glu-Cys-Ala-Phe-His-Arg”，問：1, 你認為此段肽鏈何處會出現(xiàn)β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)？2, 何處可形成鏈內(nèi)二硫鍵？3, 假定這段肽鏈是是一個大的球蛋白分子的一部分結(jié)構(gòu)，請指出Asp、Gln、Glu、Ala、Leu、Lys氨基酸殘基可能在蛋白質(zhì)分子的表面還是內(nèi)部？,什么是蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)？蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)活性有何關(guān)系？舉例說明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能之間的關(guān)系。什么是蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性作

58、用？蛋白質(zhì)變性后有哪些性質(zhì)會發(fā)生變化？簡述蛋白質(zhì)變性的機制。,.蛋白質(zhì)分子中原子和基團在三維空間的排列、分布及肽鏈走向。結(jié)構(gòu)決定功能，結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)決定其生物學(xué)功能，特定的蛋白結(jié)構(gòu)是實現(xiàn)其功能的基礎(chǔ)。舉例 ：血紅蛋白的變構(gòu)現(xiàn)象變性、復(fù)性的定義。變性后的變化：生物活性喪失，理化性質(zhì)的變化（溶解度、粘度、光學(xué)性質(zhì)等），生物化學(xué)性質(zhì)的改變（結(jié)構(gòu)松散、易被酶解）。維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象穩(wěn)定的是次級鍵

59、，和二硫鍵的一些作用，當某些因素破壞這些作用力時，蛋白空間構(gòu)像遭破壞，引起變性。,胃液pH1.5的胃蛋白酶的等電點約為1.遠比其他蛋白質(zhì)低。試問等電點如此低的胃蛋白酶必須存在大量的什么樣的官能團，什么樣的氨基酸能提供這樣的基團？ -COO-；Asp ,Glu,扼要解釋為什么大多數(shù)球蛋白在溶液中具有下列性質(zhì)。在低pH時沉淀。在離子強度從零逐漸增加時，其溶解度開始增加，然后下降，最后出現(xiàn)沉淀。在一定

60、的離子強度下，達到等電點pH時，變現(xiàn)最小的溶解度。加熱時沉淀。加入一種與水混容的非極性溶劑減小其介質(zhì)的介電常數(shù)，而導(dǎo)致溶解度的減小。,（1）低pH，蛋白質(zhì)帶大量正電荷，分子內(nèi)正電荷相斥使蛋白變性，內(nèi)部疏水基團暴露使蛋白質(zhì)溶解度降低，沉淀。（2）加少量鹽有利于穩(wěn)定帶電基團，增加蛋白質(zhì)溶解度，鹽濃度增大則鹽離子奪取與蛋白結(jié)合的水分子，降低蛋白的水合度，使蛋白沉淀。（3）等電點是，蛋白分子間靜電斥力最小，溶解度小。（4）加熱是蛋白質(zhì)變