遺傳與育種

1、微生物的遺傳育種技術(shù),理想的工業(yè)發(fā)酵菌種應(yīng)符合以下要求：,①遺傳性狀穩(wěn)定；②生長速度快，不易被噬菌體等異種微生物污染；③目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量盡可能接近理論轉(zhuǎn)化率；④目標(biāo)產(chǎn)物最好能分泌到細(xì)胞外，以降低產(chǎn)物抑制并利于分離；⑤盡可能減少產(chǎn)物類似物的產(chǎn)量，以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量并利于分離；⑥培養(yǎng)基成分簡單、來源廣、價(jià)格低廉；⑦對溫度、pH、離子強(qiáng)度、剪切力等環(huán)境因素不敏感；⑧對溶氧的要求低，便于培養(yǎng)及降低能耗。,微生物的獨(dú)特生物學(xué)特性：,

2、（1）個(gè)體的體制極其簡單；（2）營養(yǎng)體一般都是單倍體；（3）易于在成分簡單的組合培養(yǎng)基上大量生長繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于積累不同的中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物；（6）菌落形態(tài)特征的可見性和多樣性；（7）環(huán)境條件對微生物群體中各個(gè)個(gè)體作用的直接性和均一性；（8）易于形成營養(yǎng)缺陷型；（9）各種微生物一般都有相應(yīng)的病毒；（10）存在多種處于進(jìn)化過程中的原始有性生殖方式；,微生物是研究現(xiàn)代遺傳學(xué)和其它許多

3、主要的生物學(xué)基本理論問題中最熱衷的研究對象。對微生物遺傳規(guī)律的深入研究，不僅促進(jìn)了現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物工程學(xué)的發(fā)展，而且為育種工作提供了豐富的理論基礎(chǔ)，促使育種工作從不自覺到自覺、從低效到高效、從隨機(jī)到定向、從近緣雜交到遠(yuǎn)緣雜交的方向發(fā)展。,研究微生物遺傳學(xué)的意義,遺傳與變異的概念,遺傳和變異是生物體的最本質(zhì)的屬性之一。遺傳(heredity)：親代生物的性狀在子代得到表現(xiàn)；親代生物傳遞給子代一套實(shí)現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息。特點(diǎn)：具

4、穩(wěn)定性。遺傳型（genotype）：又稱基因型，指某一生物個(gè)體所含有的全部基因的總和；------是一種內(nèi)在可能性或潛力。 遺傳型 + 環(huán)境條件 表型表型（phenotype）：指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和;------是一種現(xiàn)實(shí)存在，是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。,變異(variation):生物體在外因

5、或內(nèi)因的作用下，遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變。變異的特點(diǎn)：a.在群體中以極低的幾率出現(xiàn)，（一般為10-6～10-10）；b.形狀變化的幅度大； c. 變化后形成的新性狀是穩(wěn)定的，可遺傳的。飾變（modification）：指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。特點(diǎn)是：a.幾乎整個(gè)群體中的每一個(gè)個(gè)體都發(fā)生同樣的變化；b.性狀變化的幅度??；c.因遺傳物質(zhì)不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消失后，表型即可恢復(fù)。,

6、例如：粘質(zhì)沙雷氏菌：在25℃下培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素；在37℃下培養(yǎng)，不產(chǎn)生色素；如果重新將溫度降到25℃，又恢復(fù)產(chǎn)色素的能力。,遺傳與變異的概念,第一章 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),種質(zhì)連續(xù)理論：1883~1889年間Weissmann提出。認(rèn)為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物?；?qū)W說：1933年摩爾根（Thomas Hunt Morgan）發(fā)現(xiàn)了染色體，并證明基因在染色體上呈直線排列，提出了基因?qū)W說，使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮

7、小到染色體上。但染色體是由核酸和蛋白質(zhì)兩種長鏈高分子組成。20多種氨基酸經(jīng)過不同排列組合，可以演變出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達(dá)到一個(gè)天文數(shù)字，而核酸的組成卻簡單得多，一般僅由4種不同的核苷酸組成，它們通過排列核組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸，因此當(dāng)時(shí)認(rèn)為決定生物遺傳型的染色體和基因，其活性成分是蛋白質(zhì)。DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明：1944年以后，先后有利用微生物為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行的三個(gè)著名實(shí)驗(yàn)的論證（肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、噬菌體感染試驗(yàn)、病

8、毒的拆開與重建試驗(yàn)），才使人們普遍接受核酸才是真正的遺傳物質(zhì)。,（一）核酸存在的七個(gè)水平及質(zhì)粒細(xì)胞水平：存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體，單核或多核細(xì)胞核水平: 原與真核生物的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不同，核外DNA染色體水平: 倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位，長度與信息量，轉(zhuǎn)錄——翻譯密碼子水平：

9、信息單位,起始和終止,核苷酸水平：突變或交換單位，四種堿基,一、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式,二、原核生物的質(zhì)粒,定義：是一類小型閉合環(huán)狀核外雙螺旋DNA分子，能獨(dú)立于細(xì)胞核進(jìn)行自主復(fù)制。大小：約為2~100×106Dalton，上面攜帶有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)基因。性質(zhì)：①可以在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體之外獨(dú)立存在（游離態(tài)），也可以通過交換摻入染色體上，以附加體（episome）的形式存在；②質(zhì)粒是一種復(fù)制子（r

10、eplicon），根據(jù)自我復(fù)制能力的不同，可把質(zhì)粒復(fù)制的控制形式分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種，嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受細(xì)胞核控制，與染色體DNA復(fù)制相伴隨,一般一個(gè)寄主細(xì)胞內(nèi)只有少數(shù)幾個(gè)（1~5）個(gè)拷貝；松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受細(xì)胞核控制，在染色體DNA復(fù)制停止的情況下仍可以進(jìn)行復(fù)制，在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量可以達(dá)到10~200個(gè)或更多。,③可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合作用而由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)菌細(xì)胞中，使兩個(gè)細(xì)胞都成為帶有質(zhì)粒的細(xì)胞；質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí)，它可以單獨(dú)轉(zhuǎn)

11、移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進(jìn)行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。④對于細(xì)菌的生存并不是必要的⑤功能多樣化,二、原核生物的質(zhì)粒,功能：進(jìn)行細(xì)胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。重組：在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間均可發(fā)生。存在范圍：很多細(xì)菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤桿菌等制備：包括增殖、裂解細(xì)胞、去除RNA和蛋

12、白質(zhì)等成分、分離質(zhì)粒與染色體DNA等步驟。鑒定：電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法,二、原核生物的質(zhì)粒,幾種代表性質(zhì)粒：,1. F–因子（fertility factor）：又稱致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相當(dāng)于核染色體DNA2%的環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼94個(gè)中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。存在于腸細(xì)菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細(xì)菌中

13、，決定性別。,最初發(fā)現(xiàn)于痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae），后來發(fā)現(xiàn)還存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相連的兩個(gè)DNA片段組成，即抗性轉(zhuǎn)移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性決定R因子（r-determinant），RTF為分子量約為11×106Dalton，控制質(zhì)粒co

14、py數(shù)及復(fù)制，轉(zhuǎn)移?？剐詻Q定因子大小不固定，從幾百萬到100×106Dalton以上，其上帶有其它抗生素的抗性基因。R-因子在細(xì)胞內(nèi)的copy數(shù)可從1~2個(gè)到幾十個(gè)，分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)粒可達(dá)2000~3000個(gè)/細(xì)胞。,2. R因子（resistence factor）,細(xì)菌素產(chǎn)大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的細(xì)菌素，能通過抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等而專一地

15、殺死其它腸道細(xì)菌。其分子量約4×104~8×104Dalton。大腸桿菌素都是由Col因子編碼的。Col因子可分為兩類，分別以ColE1和ColIb為代表。ColE1分子量約為5×106Dalton，無接合作用，是多copy的； ColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組DNA 的研究和用于體外復(fù)制系統(tǒng)上。ColIb分子量約為80×106Dalton，它與F因子相似，具有通過接合作用轉(zhuǎn)移的功能

16、，屬于嚴(yán)緊型控制，只有1~2個(gè)copy。凡帶Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。,3. Col因子（colicinogenic factor）,降解性質(zhì)粒只在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質(zhì)?？蔀橐幌盗心芙到鈴?fù)雜物質(zhì)的酶編碼，從而能利用一般細(xì)菌所難以分解的物質(zhì)做碳源。這些質(zhì)粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟腦）質(zhì)粒，XYL（二甲苯）質(zhì)粒，SAL（水楊酸）質(zhì)粒，MDL（扁桃

17、酸）質(zhì)粒，，NAP（奈）質(zhì)粒和TOL（甲苯）質(zhì)粒等。,4. 降解性質(zhì)粒,即誘癌質(zhì)粒。存在于根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起許多雙子葉植物的根癌。當(dāng)細(xì)菌侵入植物細(xì)胞中后，在其細(xì)胞中溶解，把細(xì)菌的DNA釋放到植物細(xì)胞中。這時(shí)，含有復(fù)制基因的Ti質(zhì)粒的小片段與植物細(xì)胞中的核染色體發(fā)生整合，破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而使它轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞。Ti質(zhì)粒長200kb，是一個(gè)大型質(zhì)粒。當(dāng)前，Ti質(zhì)粒

18、已成為植物遺傳工程研究中的重要載體。一些具有重要性狀的外源基因可借DNA重組技術(shù)設(shè)法插入到Ti質(zhì)粒中，并進(jìn)一步使之整合到植物染色體上，以改變該植物的遺傳性，達(dá)到培育植物優(yōu)良品種的目的。,5. Ti質(zhì)粒（tumor inducing plasmid）,是近年來在Rhizobium（根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒，分子量為200~300×106Dalton，比一般質(zhì)粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質(zhì)粒，其上有一系列固氮基因。,6. 巨大質(zhì)

19、粒（mega質(zhì)粒）,第二章 基因突變和誘變育種,突變（ mutation ）：指生物體的表型突然發(fā)生的可遺傳的變化。 染色體畸變——細(xì)胞學(xué)上可以看到染色體的變化突變 基因突變——細(xì)胞學(xué)上看不到遺傳物質(zhì)的變化突變體（mutant）：發(fā)生了突變的微生物細(xì)胞或菌株野生型（wild type）：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株,,,★依表型的改變分為：

20、形態(tài)突變型——個(gè)體和菌落形態(tài)的變異營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失產(chǎn)生某種生物合成酶的能力，并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型。發(fā)酵突變型——喪失產(chǎn)生某種生物合成酶能力的突變型抗性突變型——因突變而產(chǎn)生了對某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型抗原突變型——因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變產(chǎn)量突變型——,（一）基因突變的類型,★按是

21、否比較容易、迅速地分離到發(fā)生突變的細(xì)胞來分：選擇性突變株（selective mutant）：具有選擇標(biāo)記（如營養(yǎng)缺陷性、抗性突變型、條件致死突變型），只要選擇適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，就比較容易檢出和分離到。非選擇性突變株（non-selective mutant）：無選擇標(biāo)記（如產(chǎn)量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。,定義：每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的

22、幾率。突變率為10–8是指該細(xì)胞在一億次細(xì)胞分裂中，會(huì)發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。如一個(gè)含108個(gè)細(xì)胞的群體，當(dāng)其分裂為2×108個(gè)細(xì)胞時(shí)，即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10–8 。突變率=突變細(xì)胞數(shù)/分裂前群體細(xì)胞數(shù)突變是獨(dú)立的。某一基因發(fā)生突變不會(huì)影響其它基因的突變率。在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)發(fā)生兩個(gè)基因突變的幾率是極低的，因?yàn)殡p重突變型的幾率只是

23、各個(gè)突變幾率的乘積。由于突變的幾率一般都極低，因此，必須采用特殊手段篩選突變株加以確定。,（二）突變率,若干細(xì)菌某一性狀的自發(fā)突變率,菌 名 突變性狀突變率E. coli抗T1噬菌體3 ×10–8E. coli抗T3噬菌體1 ×10–7 E. coli不發(fā)酵乳糖1 ×10–10E. coli 抗紫外線1 ×10–5Staphylococcu

24、s aureus 抗青霉素1 ×10–7S. aureus 抗鏈霉素1 ×10–9 Salmonella typhi抗25?g/L鏈霉素1 ×10–6 Bacillus megaterium 抗異煙肼5 ×10–5,（三）突變的特點(diǎn),適用于整個(gè)生物界，以細(xì)菌的抗藥性為例。不對應(yīng)性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應(yīng)關(guān)系。自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)

25、地產(chǎn)生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。獨(dú)立性：各種突變獨(dú)立發(fā)生，不會(huì)互相影響?？烧T發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。可逆性：從原始的野生型基因到變異株的突變稱為正向突變（forward mutation），從突變株回到野生型的過程則稱為回復(fù)突變或回變（back mutation或reverse mutation）。,（四）基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性的證明,在各種基因突變中，抗性突變最為常見。但在過去相當(dāng)長時(shí)

26、間內(nèi)對這種抗性產(chǎn)生的原因爭論十分激烈。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，突變是通過適應(yīng)而發(fā)生的，即各種抗性是由其環(huán)境（指其中所含的抵抗對象）誘發(fā)出來的，突變的原因和突變的性狀間是相對應(yīng)的，并認(rèn)為這就是“定向變異”，也有人稱它為“馴化”或“馴養(yǎng)”。另一種看法則認(rèn)為，基因突變是自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對的。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯(cuò)綜在一起，所以難以探究問題的實(shí)質(zhì)。從1943年起，經(jīng)過幾個(gè)嚴(yán)密而巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要攻克了檢出

27、在接觸抗性因子前已產(chǎn)生的自發(fā)突變株的難題，終于解決了這場紛爭。,變量試驗(yàn)又稱波動(dòng)試驗(yàn)或彷徨試驗(yàn)。1943年，S. E. Luria 和M. Delbrück 根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，設(shè)計(jì)了左方的實(shí)驗(yàn)。,1. 變量試驗(yàn)fluctuation test,2.涂布試驗(yàn),原理與變量試驗(yàn)相同，方法更為簡便，且可計(jì)算突變率。,,涂布試驗(yàn)中突變率的計(jì)算,初始接種量：5 × 104 個(gè)/皿培養(yǎng)5小時(shí)，繁殖了12.3代，每個(gè)微菌落約含51

28、00個(gè)細(xì)菌這時(shí)，每個(gè)平皿上的細(xì)胞數(shù)為：5100 × 5 × 104 ≈ 2.6 ×108個(gè)/皿在6個(gè)平板上，比接種時(shí)增加的細(xì)胞數(shù)為：6 ×（2.6 × 108 ? 5 × 104）= 15.6 ×108在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn)28個(gè)突變，故突變率 = 28/15.6 ×108 = 1.8 ×10?8,3. 平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)（replic

29、a plating）,1952年，J. Lederberg夫婦的論文《平板影印培養(yǎng)法和細(xì)菌突變株的間接選擇》，更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產(chǎn)生的，這一突變與相應(yīng)藥物環(huán)境毫不相干。平板影印培養(yǎng)法，是一種能達(dá)到在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上出現(xiàn)相同遺傳型菌落的接種培養(yǎng)方法：把長有許多菌落的母種培養(yǎng)皿倒置于包有滅菌絲絨布的木質(zhì)圓柱印章上，使其沾上來自平板上的菌落。然后可把這一“印章”上的菌落一一接種到不同的選擇性培養(yǎng)基平板上

30、。待這些平板培養(yǎng)后，對各平板相同位置上的菌落作對比后，就可選出適當(dāng)?shù)耐蛔冃途?。?jù)報(bào)道，用此法可把母平板上10~20%量的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到絲絨布上，并可利用這一“印章”接種8個(gè)子培養(yǎng)皿。因此，通過影印培養(yǎng)法，就可以從在非選擇性條件下生長的細(xì)菌群體中，分離出各種類型的突變株。,平板影印培養(yǎng)法,在根本未接觸過任何一點(diǎn)鏈霉素的情況下，就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株，充分說明了突變是自發(fā)產(chǎn)生的，鏈霉素只是起到了一種檢出作用。平板影印培養(yǎng)不僅在微生

31、物遺傳理論的研究中有重要應(yīng)用，而且在育種時(shí)間和其它研究中均有應(yīng)用，值得很好地領(lǐng)會(huì)。,（五）基因突變的機(jī)制,基因突變的原因是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的，誘變又可分為點(diǎn)突變和畸變。具體類型可歸納如下：,1. 誘變機(jī)制,誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑種類：誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有幾種作用方式。按照遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的特點(diǎn)討論幾種有代表性的誘變劑的作用機(jī)制。,（1）

32、堿基置換（substitution）,定義：對DNA來說，堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷（microlesion），一般也稱點(diǎn)突變（point mutation）。它只涉及一對堿基被另一對堿基所置換。分類：轉(zhuǎn)換（transition），即DNA鏈中的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶所置換； 顛換（transversion），即一個(gè)嘌呤被一個(gè)嘧啶,或是一個(gè)嘧啶被一個(gè)嘌呤所置換。,對某一具體誘變劑來說，即可

33、同時(shí)引起轉(zhuǎn)換與顛換，也可只具其中的一種功能。根據(jù)化學(xué)誘變劑是直接還是間接地引起置換，可把置換的機(jī)制分成以下兩類來討論。,,,★直接引起置換的誘變劑,定義：一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的誘變劑，不論在機(jī)體內(nèi)或是在離體條件下均有作用。種類：很多。例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。作用：它們可與一個(gè)或幾個(gè)核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，

34、從而引起DNA復(fù)制時(shí)堿基配對的轉(zhuǎn)換，并進(jìn)一步使微生物發(fā)生變異。羥胺只引起G┇C→A : T，其余都是可使G┇C=A : T發(fā)生互變的。能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有.,亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。 HNO2胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）

35、 HNO2腺嘌呤（A） 次黃嘌呤（H） HNO2鳥嘌呤（G） 黃嘌呤（X）這些反應(yīng)及形成物均可在DNA復(fù)制中產(chǎn)生影響，主要是使堿基對發(fā)生轉(zhuǎn)換。,,,,堿基轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制——以亞硝酸為例,,腺嘌呤（A）變成次黃嘌

36、呤（H）后引起的轉(zhuǎn)換過程：,①腺嘌呤氧化脫氨后形成烯醇式次黃嘌呤（He） ② He通過互變異構(gòu)效應(yīng)形成酮式次黃嘌呤（HK）③DNA復(fù)制時(shí)，HK 與胞嘧啶（C）配對④ DNA第二次復(fù)制時(shí)，C與G正常配對，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)換。,亞硝酸引起的AT-GC轉(zhuǎn)換細(xì)節(jié),這類誘變劑主要是一些堿基類似物 ,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5—AU）、疊氮胸腺嘧啶（AIT）等等； 作用方式：通過活細(xì)胞的代謝活動(dòng)參入到DNA分子中，主要是在D

37、NA復(fù)制時(shí)堿基類似物插入DNA中，引起堿基對配對錯(cuò)誤，造成堿基置換。以5-溴尿嘧啶(5-BU)為例： 5-BU是胸腺嘧啶（T）的的類似物 ，酮式的5-BU可以和A配對，烯醇式的5-BU可以和G配對，在DNA分子復(fù)制的過程中，由于5-BU的插入和互變異構(gòu)導(dǎo)致堿基置換。,★間接引起置換的誘變劑,5-BU引起的轉(zhuǎn)換,5-BU引起的轉(zhuǎn)換,從上圖中，還可以看到5-BU的摻入引起的G┇C回復(fù)到A?T的過程。通過這兩個(gè)圖示，就很容易理解為什么同

38、一種誘變劑既可造成正向突變，又可使它產(chǎn)生回復(fù)突變的原因了。也可以知道，為什么像5-BU這類代謝類似物只有對正在進(jìn)行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對休止細(xì)胞、游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。,（2）移碼突變,frame-shift mutation 或 phase-shift mutation，指誘變劑使DNA分子中增加（插入）或缺失一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變。

39、由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株（frame-shift mutant）。與染色體畸變相比，移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷。丫啶類染料，包括原黃素、丫啶黃、丫啶橙和α-氨基丫啶等，以及一系列稱為ICR類的化合物，都是移碼突變的有效誘變劑。,,圖8-14——能誘發(fā)移碼突變的幾種代表性化合物,引起移碼突變的誘變劑：主要是吖啶類染料，如吖啶黃、吖啶橙等等。這類化合物都是平面型的三環(huán)分子，它們的結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤—嘧啶對十分相似

40、。,丫啶類化合物的誘變機(jī)制：,至今還不很清楚。有人認(rèn)為，由于它們是一種平面型三環(huán)分子，結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤–嘧啶對十分相似，故能嵌入兩個(gè)相鄰DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開（兩個(gè)堿基對原來相距0.34nm，當(dāng)嵌入一個(gè)丫啶分子時(shí)，就變成0.68nm），從而在DNA復(fù)制過程中，會(huì)使鏈上增添或缺失一個(gè)堿基，結(jié)果就引起了移碼突變。,丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示：,（3）染色體畸變（chromosomal aberration）,

41、某些理化因子，如X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起點(diǎn)突變外，還會(huì)引起DNA的大損傷（macrolesion）——染色體畸變，它包括：染色體結(jié)構(gòu)上的變化：缺失（deletion）重復(fù)（duplication）易位（translocation）倒位（inversion）染色體數(shù)目的變化,★染色體結(jié)構(gòu)上的變化,分為染色體內(nèi)畸變和染色體間畸變兩類。染色體內(nèi)畸變：只涉及一條染色體上的變化，如發(fā)生染色體的部分缺失或重復(fù)時(shí)，

42、其結(jié)果可造成基因的減少或增加；如發(fā)生倒位或易位時(shí)，則可造成基因排列順序的改變，但數(shù)目卻不改變。倒位--------是指斷裂下來的一段染色體旋轉(zhuǎn)180?后，重新插入到原來染色體的原位置上，從而使其基因順序與其它的基因順序相反；易位--------是指斷裂下來的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上。染色體間畸變：指非同源染色體間的易位。,,染色體畸變,轉(zhuǎn)座因子（transposible element）,由40年

43、代B. McClintock對的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位，自1967年以來，已在微生物和其它生物中得到普遍證實(shí)，并已成為分子遺傳學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。舊概念：基因是固定在染色體DNA上的一些不可移動(dòng)的核苷酸片段。新發(fā)現(xiàn)：有些DNA片段不但可在染色體上移動(dòng)，還可從一個(gè)染色體跳到另一個(gè)染色體，從一個(gè)質(zhì)粒跳到另一個(gè)質(zhì)?；蛉旧w，甚至還從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。在這些DNA順序的跳躍過程中，往往導(dǎo)致DNA鏈的斷裂或重接，從而產(chǎn)生重組交換或使

44、某些基因啟動(dòng)或關(guān)閉，結(jié)果導(dǎo)致突變的發(fā)生。轉(zhuǎn)座因子（transposible element）：在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA順序。也稱作跳躍基因（jumping gene）或可移動(dòng)基因（movable gene）。,轉(zhuǎn)座因子的種類（1）,插入序列（IS，insertion sequence）：特點(diǎn)是分子量最?。▋H0.7~1.4kb），只能引起轉(zhuǎn)座（transposition）效應(yīng)而不含其它基因?？梢栽谌旧w、F因子

45、等質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)它們。已知的IS有5種，即 IS1、IS2、IS3、IS4和IS5。E . coli的F因子和核染色體組上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通過這些同源序列間的重組，就可使 F因子插入到E . coli的核染色體組上，從而使后者成為Hfr菌株。因IS在染色體組上插入的位置和方向的不同，其引起的突變效應(yīng)也不同。IS引起的突變可以回復(fù)，其原因可能是IS被切離，如果因切離部位有誤而帶走IS以外的一部分DNA序列，就會(huì)在插入部

46、位造成缺失，從而發(fā)生新的突變。,轉(zhuǎn)座因子的種類（2）,轉(zhuǎn)座子（Tn，transposon，又稱轉(zhuǎn)位子，易位子）：與IS和Mu噬菌體相比，Tn的分子量是居中的（一般為2~25kb）。它含有幾個(gè)至十幾個(gè)基因，其中除了與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因外，還含有抗藥基因或乳糖發(fā)酵基因等其它基因。Tn雖能插到受體DNA分子的許多位點(diǎn)上，但這些位點(diǎn)似乎也不完全是隨機(jī)的，其中某些區(qū)域更易插入。,轉(zhuǎn)座因子的種類（3）,Mu噬菌體（即 mutator phage，誘

47、變噬菌體）：它是E . coli的一種溫和噬菌體。與必須整合到宿主染色體特定位置上的一般溫和噬菌體不同，Mu噬菌體并沒有一定的整合位置。與以上的IS和Tn兩種轉(zhuǎn)座因子相比，Mu噬菌體的分子量最大（37kb），它含有20多個(gè)基因。Mu噬菌體引起的轉(zhuǎn)座可以引起插入突變，其中約有2%是營養(yǎng)缺陷型突變。,若干誘變劑的作用機(jī)制及誘變功能,誘變因素在DNA上的初級(jí)效應(yīng) 遺傳效應(yīng)堿基類似物 摻入作用

48、 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 羥 胺 與胞嘧啶起反應(yīng)GC→AT的轉(zhuǎn)換 亞硝酸 A、G、C的氧化脫氨作用AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 交 聯(lián) 缺失 烷化劑 烷化堿基（主要是G） AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 烷化磷酸基團(tuán)

49、 AT→TA的顛換 喪失烷化的嘌呤 GC→CG的顛換糖-磷酸骨架的斷裂巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位）丫啶類 堿基之間的相互作用（雙鏈變形） 碼組移動(dòng)（＋或－）紫外線 形成嘧啶的水合物 GC→AT轉(zhuǎn)換 形成嘧啶的二聚體碼組移動(dòng)（＋或－） 交 聯(lián)

50、 電離輻射 堿基的羥基化核降解 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 DNA降解 碼組移動(dòng)（＋或－） 糖-磷酸骨架的斷裂巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位） 喪失嘌呤 加熱

51、 C脫氨基 CG→TA轉(zhuǎn)換 Mu噬菌體 結(jié)合到一個(gè)基因中間 碼組移動(dòng),,2.自發(fā)突變機(jī)制,自發(fā)突變是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變。幾種自發(fā)突變的可能機(jī)制★微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)：過氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物。它對Neurospora（脈孢菌）有誘變作用，這種作用可因同時(shí)加入過氧化氫酶而降低，如果在加入

52、該酶的同時(shí)又加入酶抑制劑KCN，則又可提高突變率。這就說明，過氧化氫很可能是“自發(fā)突變”中一種內(nèi)源性誘變劑。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣的原因?！镉杀尘拜椛浜铜h(huán)境因素引起：天然的宇宙射線,★互變異構(gòu)效應(yīng)：,堿基T、G的第六位上是酮基，會(huì)以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)C、A的第六位上是氨基，會(huì)以氨基式或亞氨基式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)平衡一般趨向于酮式或氨基式，在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中一般總是以A︰T和G┇

53、C堿基配對的形式出現(xiàn)在偶然情況下，在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，在T以稀有的烯醇式出現(xiàn)時(shí)，其相對位置上就出現(xiàn)G同樣，如果C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，則在新合成DNA單鏈中與C相對應(yīng)的位置上就將是A。這可能就是發(fā)生相應(yīng)的自發(fā)突變的原因。要預(yù)言在某一時(shí)間、某一基因發(fā)生自發(fā)突變是不可能的。在運(yùn)用數(shù)學(xué)方法對這些偶然事件做大量統(tǒng)計(jì)分析后，可以發(fā)現(xiàn)并掌握其中的規(guī)律。例如，據(jù)統(tǒng)計(jì)，堿基對發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為10

54、–8 ~ 10 – 9。,（六）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù),已知的DNA損傷類型很多，機(jī)體對其修復(fù)的方式也各異。發(fā)現(xiàn)較早和研究得較深入的是紫外線（U.V.，ultraviolet ray）的作用。嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌呤強(qiáng)得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物。其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消除。紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體。二聚體的出現(xiàn)會(huì)減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)

55、構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對，從而有可能引起突變或死亡。在互補(bǔ)雙鏈間形成嘧啶二聚體的機(jī)會(huì)較少。但一旦形成，就會(huì)妨礙雙鏈的解開，因而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并使細(xì)胞死亡。,,光復(fù)活作用（photoreactivation）,定義：經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時(shí)，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。這一現(xiàn)象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomyces griseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來，在許

56、多微生物中都得到了證實(shí)。最明顯的是在E.coli的實(shí)驗(yàn)中：對照：8×106個(gè)/ml E.coli U.V. 100個(gè)/ml E.coli試驗(yàn)：8×106個(gè)/ml E.coli U.V. 360~490nm 2×106個(gè)/ml E.coli 可見光，30分經(jīng)紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶

57、二聚體的DNA分子，在黑暗下會(huì)被一種光激活酶（photoreactivating enzyme）即光裂合酶（photolyase）結(jié)合，當(dāng)形成的復(fù)合物暴露在可見光（300~500nm）下時(shí)，此酶會(huì)因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。與此同時(shí)，光激活酶也從復(fù)合物中釋放出來，以便重新執(zhí)行功能。每一E.coli細(xì)胞中約含有25個(gè)光激活酶分子。由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用，所以進(jìn)行紫外線誘變育種時(shí)，只能在紅光下照射及處理

58、照射后的菌液。,,,圖:光復(fù)活作用,暗修復(fù)作用（dark repair）,又稱切除修復(fù)（excision repair）。是活細(xì)胞內(nèi)一種用于修復(fù)被紫外線等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機(jī)制。這種修復(fù)作用與光無關(guān)。有四種酶參與——①內(nèi)切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5’一側(cè)切開一個(gè)3’-OH和5’-P的單鏈缺口；②外切核酸酶從5’-P至3’-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口；③DNA聚合酶以DNA的另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原

59、有鏈上暴露的3’-OH端起逐個(gè)延長，重新合成一段缺失的DNA鏈；④通過連接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3’-OH末端與原鏈的5’-P末端相連接，從而完成了修復(fù)作用。,暗修復(fù)作用（dark repair）,1、由核酸內(nèi)切酶切開二聚體的5’末端，形成3’-OH和5’-P的單鏈缺口2、核酸外切酶從5’-P到3’-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口。3、DNA聚合酶以另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起合成缺失片段。4、連接酶

60、將新合成的3’-OH與原有的5’-P相連接。,誘變育種：是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。,誘變育種具有極其重要的實(shí)踐意義。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。,（七）誘變育種,誘變育種的步驟：,原始菌種,純化,斜面/肉湯培養(yǎng),單孢子/單細(xì)胞懸液,誘變劑處理,平板分離,移

61、至斜面,小試,中試,初篩,復(fù)篩,,,,,,,,,,,計(jì)算存活率,觀察形態(tài)變異，挑單菌落,良種保藏,原菌種特性鑒定,1.出發(fā)菌株的選擇：出發(fā)菌株———用來育種處理的起始菌株◆出發(fā)菌株應(yīng)具備： ①對誘變劑的敏感性高； ②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力； ◆出發(fā)菌株的來源； ①自然界直接分離到的野生型菌株： ②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株： ③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株：,2.制備細(xì)胞懸液要求：

62、①菌體處于對數(shù)生長期，并使細(xì)胞處于同步生長； ②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，以避免表型遲延現(xiàn)象（phenotypic lag）;方法： ①玻璃珠打散10-15min; ②加０.3%吐溫80（表面活性劑） ③用無菌脫脂棉過濾。 濃度： 細(xì)菌、放線菌 108個(gè)/ml 霉菌、酵母菌 106個(gè)/ml,表型遲延現(xiàn)象：指某一突變在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，

63、才在表型上顯示出來，造成不純的菌落。產(chǎn)生原因：①分離性遲延現(xiàn)象②生理性遲延現(xiàn)象,3.誘變處理：誘變劑的作用： ①提高突變的頻率 ②擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度 ③使產(chǎn)量變異朝著正突變或負(fù)突變移動(dòng)劑量的表示法：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量?！滤缆适亲詈玫恼T變劑相對劑量的

64、表示方法。最適劑量的選擇：產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在70~80%）,,誘變劑劑量一般指強(qiáng)度與作用時(shí)間的乘積。各種誘變劑有不同的劑量表示方式，如化學(xué)誘變劑以一定溫度下誘變劑的濃度和處理時(shí)間來表示。在育種實(shí)踐中，常以殺菌率來作誘變劑的相對劑量。誘變劑的合適劑量：凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，能擴(kuò)大變異幅度，促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。要確定一個(gè)合適的劑量，常常要經(jīng)過多次試驗(yàn)。就一般微生物而言，在一定的劑量范圍內(nèi)

65、，突變率往往隨劑量的增高而提高，但正變較多出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變則較多出現(xiàn)在偏高的劑量中；還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，更容易出現(xiàn)負(fù)變。因此，在誘變育種工作中，目前大家比較傾向于采用較低的劑量。,選擇誘變劑的種類：在選用理化因子作誘變劑時(shí)，在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。,紫外

66、誘變方法:,設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等，紫外燈：波長為253.7nm, 功率是15W處理時(shí)的照射距離：20cm — 30cm樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm照射時(shí)，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時(shí)間或死亡率作為相對劑量。,由于微生物接受的照射劑量與燈的功率、照射距離、照射時(shí)間、菌液濃度、菌液厚度、細(xì)胞本身特性等因素有關(guān)，所以單純用時(shí)間表示照射劑量并不完全可靠。一定的死亡率必定對應(yīng)一定的照射劑量，

67、所以，在實(shí)際應(yīng)用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。 通常先繪制照射時(shí)間與死亡率的關(guān)系曲線，然后選擇合適的劑量。 生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量： 死亡率為70%——80%左右。,,,艾姆斯試驗(yàn)測定潛在化學(xué)致癌物的基本原理,艾姆斯試驗(yàn)測定潛在化學(xué)致癌物的基本原理Salmonella typhimurium的組氨酸缺陷型（his―）菌株在 [―]平板上不能生長，如發(fā)生回復(fù)突變則能生長。如將可疑“三致”物黃曲霉毒素，加入鼠肝勻漿，保溫一段

68、時(shí)間后，吸入濾紙片中，然后將濾紙片放置于[―]平板中央。經(jīng)培養(yǎng)后，出現(xiàn)三種情況：如在平板上無大量菌落產(chǎn)生，說明試樣中不含誘變劑；如在紙片周圍有一抑制圈，其外才是大量菌落，說明試樣中某誘變劑的濃度很高；如在紙片周圍即生長大量菌落，說明誘變劑的濃度合適。目前，艾姆斯試驗(yàn)法已廣泛用于檢測食品、飲料、藥物核引水等試樣中的致癌物。它具有快速（僅3天左右）、準(zhǔn)確（檢測致癌物的符合率＞85%）和費(fèi)用省等優(yōu)點(diǎn)。,,Ames test：對化學(xué)誘變劑做檢

69、測,菌種：鼠傷寒沙門氏菌 his -； 原理： his -在基本培養(yǎng)基上不長；而發(fā)生回復(fù)突變則長。,Ames test 方法示意圖,4. 菌種篩選,,4.1 篩選方案：實(shí)際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)；——因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡