愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)與產(chǎn)前診斷-課件

1、分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)與產(chǎn)前診斷,南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院王亞平2006年11月,基因診斷的中心問(wèn)題是認(rèn)識(shí)遺傳變異、基因突變及與表型之間的關(guān)系,一、分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in site hybridization, FISH）：用熒光物質(zhì)標(biāo)記特異性DNA探針，與中期細(xì)胞染色體或間期細(xì)胞核雜交，鑒別和確定出生缺陷、腫瘤細(xì)胞染色體異常，分辨率可達(dá)50－500 kb.,熒光原位雜交技術(shù)（Fluoresce

2、nce in site hybridization, FISH）的特異性DNA探針,基因座特異性探針：克隆擴(kuò)增獲得。在基因制圖方面的努力，越來(lái)越多的這方面探針可以使用著絲粒重復(fù)序列探針：這些特異性的探針可在中期染色體和間期細(xì)胞核中產(chǎn)生強(qiáng)烈信號(hào)，可以鑒別特異性染色體。全染色體涂染探針：通過(guò)對(duì)來(lái)自特異性染色體分檢庫(kù)或僅含一條人類(lèi)染色體的雜種細(xì)胞DNA擴(kuò)增制備。這種DNA序列的混合物與一條染色體上的多個(gè)位點(diǎn)同源。因此在中期核內(nèi)，整條染色體

3、得以被涂染。通過(guò)使用不同的熒光素，在一個(gè)中期染色體涂片上可以鑒別幾條不同的染色體。,應(yīng)用15號(hào)染色體一基因特異性探針（紅色）雜交確定其是否缺失；綠色探針鑒定15號(hào)染色體著絲粒。,24種不同染色體涂染探針雜交得到的彩色染色體,染色體技術(shù)的應(yīng)用－1,inv(14)(p12q24),t(2; 11)(2q34; 11q13),細(xì)胞遺傳學(xué)研究中染色體技術(shù)的應(yīng)用—FISH技術(shù)檢出t(2; 14),染色體技術(shù)的應(yīng)用－2,inv(9)(p12q

4、13),,,分子細(xì)胞遺傳學(xué)：DMD基因第46號(hào)外顯子缺失,細(xì)胞遺傳學(xué)研究中染色體技術(shù)的應(yīng)用,9號(hào)染色體涂染探針雜交。箭頭示易位到10號(hào)染色體上的來(lái)自9號(hào)染色體的片段,21號(hào)染色體涂染探針FISH雜交，顯示21三體,比較基因組雜交（comparative genomic hybridization, CGH）,近年在FISH技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不同熒光物質(zhì)分別標(biāo)

5、記腫瘤細(xì)胞DNA和正常人細(xì)胞DNA，然后與正常人中期細(xì)胞染色體雜交。通過(guò)檢測(cè)染色體上兩種熒光信號(hào)的相對(duì)比值，了解腫瘤細(xì)胞DNA拷貝數(shù)的變化，并可在染色體上定位。這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤基因組不平衡的檢測(cè)。,比較基因組雜交的原理,待測(cè)DNA（腫瘤細(xì)胞DNA，test DNA)為綠色 參照DNA(正常細(xì)胞DNA，reference DNA）為紅色 復(fù)染為藍(lán)色,人食管鱗癌細(xì)胞株的比較基因組雜交,中期染色體的DAPI的 復(fù)染圖,B

6、. 中期染色體比較基因組雜 交（CGH）：紅色區(qū)域表示 丟失，綠色區(qū)域表示擴(kuò)增。,CGH的優(yōu)點(diǎn)：,經(jīng)一次染色體原位雜交實(shí)驗(yàn)即可在整條染色體或染色體區(qū)帶水平對(duì)待檢基因組DNA序列拷貝數(shù)改變進(jìn)行檢測(cè)和定位。無(wú)需進(jìn)行染色體培養(yǎng)，對(duì)于不易制備良好分裂相的實(shí)體瘤尤為適用。所需染色體DNA可來(lái)自各種組織，如新鮮組織、福爾馬林固定的組織、石蠟包埋組織，可在很少量的基礎(chǔ)上檢測(cè)，利于做回顧性研究。,CGH的局限性：,難以檢出以下異常：平衡易

7、位，微小突變，基因重排，倍體水平改變。結(jié)果可能受到一些因素影響：正常細(xì)胞存在，腫瘤自身的遺傳異質(zhì)性，系統(tǒng)的波動(dòng)。靈敏度：限于檢測(cè)較大范圍的缺失（10 — 30MB）,二、突變分析與分子診斷,（一）基因突變類(lèi)型,點(diǎn)突變：只有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的改變，是突變中最多見(jiàn)的形式。穩(wěn)定突變：傳遞中不改變?cè)械耐蛔?。?dòng)態(tài)突變：傳遞中不斷改變自己，多見(jiàn)于短重復(fù)序列的突變，在一代代傳遞中重復(fù)次數(shù)發(fā)生明顯變化。,點(diǎn)突變的結(jié)果：,（1）同義突變（sam

8、esense mutation）：堿基替換后，雖然密碼子發(fā)生改變，但編碼氨基酸沒(méi)有改變（遺傳密碼的兼并性），亦稱(chēng)靜止突變。（2）錯(cuò)義突變（missense mutation）：堿基替換，密碼子發(fā)生改變后，編碼氨基酸亦發(fā)生改變，編碼另一個(gè)氨基酸。 （3）無(wú)義突變（nonsense mutation）：堿基替換后，使編碼氨基酸的密碼子變成一個(gè)終止密碼子。（4）中性突變：包含兩種情況，即“同義突變”和不改變蛋白質(zhì)功能的“錯(cuò)義突變”,基因

9、突變形式—堿基的插入和缺失,堿基的插入和缺失：基因編碼序列中插入或丟失一個(gè)或幾個(gè)堿基，其結(jié)果是突變點(diǎn)下游堿基序列發(fā)生移碼，編碼氨基酸序列都發(fā)生改變，又稱(chēng)移碼突變（frameshift mutation），并可在突變點(diǎn)下游提前出現(xiàn)終止密碼。,堿基的插入和缺失的結(jié)果：將導(dǎo)致移碼突變（frameshift mutation），并可在突變點(diǎn)下游提前出現(xiàn)終止密碼產(chǎn)生截短型蛋白,缺失突變,基因突變形式,框內(nèi)突變（inframe mutation）：

10、3個(gè)或是的倍數(shù)的堿基缺失或插入導(dǎo)致的突變，使基因丟失或增加1個(gè)或幾個(gè)氨基酸。DNA 大片段缺失或復(fù)制（large deletion or duplication)：幾百個(gè)bp至幾十個(gè)kb的堿基缺失或復(fù)制。,各種類(lèi)型病理性突變的比例,無(wú)義突變和移碼突變： 60％稀有的錯(cuò)義突變： 20％DNA大片段缺失或重復(fù): 20％另外：可能和疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有關(guān)的大量的多態(tài)位點(diǎn),,,,微小突變,,（二）目前常用的對(duì)已知點(diǎn)突變

11、的分析技術(shù),限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）等位基因特異性（PCR）擴(kuò)增（ASA）等位基因特異性寡核苷酸雜交（ ASO）DNA芯片,1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析,當(dāng)突變影響到某一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)時(shí)，可通過(guò)酶切PCR產(chǎn)物，電泳分析:限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）,2.等位基因特異性（PCR）擴(kuò)增（ASA）,通過(guò)設(shè)計(jì)兩個(gè)5’端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)。分別加入這兩種引物及3’端引物進(jìn)行兩

12、個(gè)平行的PCR，分析結(jié)果。,3.等位基因特異性寡核苷酸雜交（ ASO）,設(shè)計(jì)兩段寡核苷酸探針，其中包含發(fā)生突變的位點(diǎn)，一段與野生型鏈互補(bǔ)，一段與突變型鏈互補(bǔ)。雜交分析是否存在突變,4.基因芯片：SNP位點(diǎn)的檢測(cè),,Microarray-based method for genotyping of functional single nucleotide polymorphisms using dual-color fluor

13、escence hybridization. Mutat Res. 2004; 548: 97-105,（三）目前常用的未知基因突變分析技術(shù),異源雙鏈體形成分析（ Heteroduplex analysis, HA）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single-strand conformation analysis, SSCP）變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）

14、變性高效液相色譜分析（Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC ）,體外蛋白截短實(shí)驗(yàn)（Protein truncation test, PTT）定量多重PCR技術(shù)（Quantitative multiplex PCR, QM-PCR）多重探針連接依賴(lài)性擴(kuò)增技術(shù)（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation

15、, MLPA) DNA序列分析（DNA sequencing),1.異源雙鏈體形成分析（HA）,由突變型和野生型DNA鏈形成的異源雙鏈DNA在其錯(cuò)配處形成一個(gè)凸起，電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈DNA不同的遷移率，從而使兩者得以分離。技術(shù)路線：PCR產(chǎn)物95?C變性5分鐘，37?C復(fù)性?10分鐘。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（0.2%硝酸銀染色）,2.變性梯度凝膠電泳（DGGE）,利用不同DNA序列開(kāi)始變性時(shí)對(duì)變性劑濃度的要求不同，在

16、變性劑濃度梯度凝膠內(nèi)電泳，野生型DNA和突變型DNA序列的差異所導(dǎo)致其變性點(diǎn)不同使兩者的電泳遷移率出現(xiàn)差異,3.單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）,單鏈DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴(lài)于其堿基的序列。即使只有一個(gè)堿基的不同，也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)并可引起非變性條件下的電泳遷移率的差異。技術(shù)路線：PCR產(chǎn)物95?C變性5分鐘，立即置冰上。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。條件：電泳緩沖液0.5?TBE，電壓70v, 4?C環(huán)境下電

17、泳過(guò)夜（0.2%硝酸銀染色）。,4.體外蛋白截短試驗(yàn)（PTT）,從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)基因的突變。其原理是堿基缺失和插入導(dǎo)致的移碼突變、堿基替換出現(xiàn)的無(wú)義突變均可使基因提前出現(xiàn)終止密碼，從而截短mRNA翻譯的蛋白質(zhì)。技術(shù)路線：血細(xì)胞RNA?cDNA?RT-PCR?體外蛋白質(zhì)合成?電泳分析截短了的蛋白質(zhì)?相應(yīng)基因片段的序列分析,上游引物5’端均連接T7啟動(dòng)子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG [

18、35S]甲硫氨酸，T7 體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系（兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物），30℃孵育90 min，完成體外蛋白質(zhì)合成。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,5.變性高效液相色譜分析（DHPLC）,1995年Oefner and Underhill 首次報(bào)道DHPLC技術(shù)。其原理是在接近DNA融解溫度條件下進(jìn)行離子對(duì)反相高效液相色譜分析。DHPLC分析突變的原理：在DNA部分變性的條件下，變異型和野生型DNA可形成同源雙鏈和異源雙鏈．根據(jù)其在層析柱上保

19、留的時(shí)間可以分辨出變異性型DNA.,用離子對(duì)反相高效液相色譜檢測(cè)DNA變異是基于同時(shí)存在同源雙鏈和異源雙鏈。異源雙鏈的檢出取決于高效液相色譜的溫度。而色譜溫度的選定與野生型DNA融解溫度（Tm）有關(guān)。DHPLC與其它突變分析技術(shù)的比較: 對(duì)單個(gè)核苷酸變異的檢出率: SSCP技術(shù), 約75%； DHPLC, >90%.,DHPLC的優(yōu)點(diǎn)：,靈敏，準(zhǔn)確；分析速度快，單個(gè)樣本的分析時(shí)間僅需幾分鐘；容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作；適用于較大

20、樣本中基因突變的篩選。,DHPLC分析：（野生型）,,DHPLC分析: 突變型（單個(gè)堿基改變）,DHPLC分析: 突變型（單個(gè)堿基改變）,,6.定量多重PCR技術(shù)（Quantitative multiplex PCR，Q-M-PCR）,目前各實(shí)驗(yàn)室普遍采用的突變基因分析技術(shù)對(duì)基因微小突變的檢測(cè)具有較高的敏感性，如對(duì)單個(gè)堿基改變的檢出率可達(dá)90%以上。但對(duì)于較大的DNA缺失或DNA重復(fù)產(chǎn)生的突變，如以外顯子為單位的DNA缺失，SSCP、D

21、HPLC等均難以將其檢出。有資料表明大片段DNA缺失可占基因突變的三分之一,定量多重PCR技術(shù)要點(diǎn)：,涉及至少2個(gè)基因的多個(gè)外顯子在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中一個(gè)外顯子作為參照外顯子，其余作為檢測(cè)外顯子；控制PCR循環(huán)數(shù)，使PCR產(chǎn)物的增加處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)曲線內(nèi)；PCR產(chǎn)物于DNA測(cè)序儀電泳，其結(jié)果經(jīng)GeneScan軟件處理；,以檢測(cè)外顯子PCR產(chǎn)物與參照外顯子PCR產(chǎn)物的比值計(jì)算模版DNA相對(duì)拷貝數(shù)，確定是否存在檢測(cè)外顯子的

22、雜合性缺失；檢出的缺失經(jīng)其它方法（長(zhǎng)片段PCR或缺失斷裂點(diǎn)測(cè)序）確認(rèn)。,7. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation — MLPA,Denatured genomic DNA is hybridized with a mixture of more than 40 probes.Each MLPA probe consists of two oligonucleotides,

23、one synthetic and one M13-derived.The two part of hybridized probes are ligated.All probe ligation products are amplified by PCR using only one primer pair.Electrophoresis of PCR products on DNA Sequencer in GeneScan

24、model.,三、遺傳性疾病的診斷,遺傳性疾病的診斷：,（一）臨癥診斷（二）癥狀出現(xiàn)前的診斷（三）產(chǎn)前診斷,（一）臨癥診斷,根據(jù)就診患者的臨床表現(xiàn)作出（初步）判斷：疾病診斷，遺傳方式（1）癥狀、體征（2）系譜分析部分遺傳性疾病的診斷主要依賴(lài)于癥狀、體征對(duì)于同時(shí)存在散發(fā)病例和遺傳性病例的復(fù)雜性疾病，如腫瘤，建立相應(yīng)的臨床可疑病例的判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)不同的遺傳性疾病，選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室技術(shù)分析確診： 生化技術(shù)、細(xì)胞技術(shù)、分子技術(shù)

25、多用于對(duì)先證者的診斷,Pedigree of a family,遺傳性疾病基因診斷程序,臨床診斷和確定分析對(duì)象確定分析的目標(biāo)基因以檢測(cè)目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)確定分析的技術(shù)構(gòu)成和分析過(guò)程：基因微小變異篩查：SSCP, DGGE, DHPLC, PTT, DNA測(cè)序分析基因大片段變異（缺失或重復(fù)）的分析檢出變異的性質(zhì)評(píng)估和患者家族的遺傳咨詢。,DHPLC突變分析,體外蛋白截短試驗(yàn)（PTT） — HNPCC遺傳性突變,DNA序列分析—堿基

26、替換,,DNA序列分析—移碼突變,,DHPLC—外顯子缺失,APC 基因型和患者臨床表型關(guān)系的研究,(1) APC基因胚系突變與FAP臨床表型的相關(guān) : 位于第1309位密碼子附近的突變，患者臨床癥 狀嚴(yán)重。(2) APC基因體細(xì)胞突變與CRC生物學(xué)特征：,（二）癥狀出現(xiàn)前的診斷,應(yīng)用于發(fā)病年齡延遲的遺傳性疾病。應(yīng)用于已知遺傳性疾病家族的目前表型正常的個(gè)體。單基因顯性遺傳病的雜合子個(gè)體。動(dòng)態(tài)突變的分析。結(jié)合于遺傳咨