心血管藥理學(xué)的研究方法

1、● 心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu) 1、心臟 2、血管 (1) 動脈 主動脈 外周動脈 (2) 靜脈,● 高脂血癥的研究,● 動脈粥樣硬化的研究,● 血管再狹窄的研究,● 高脂血癥的研究,血脂異常是血中總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白—膽固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）超過正常范圍及（或）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）低下。 高脂血癥是指TC或（和）LDL-C或（和）TG增高。

2、血脂異常在動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生發(fā)展及其引起的心血管事件（CVE）中起非常重要的作用。,高TC血癥，特別是LDL-C增高，是發(fā)生CHD的最重要的危險因素。 流行病學(xué)資料顯示，芬蘭TC最高，CHD發(fā)病率也最高，日本TC最低，CHD發(fā)病率也最低。,高脂血癥患者的開始治療標(biāo)準(zhǔn)值及治療目標(biāo)值,降脂中藥篩選及藥理學(xué)研究,○ 體外模型,○ 體內(nèi)模型,體外篩選細(xì)胞模型(研究階段),肝細(xì)胞,卵細(xì)胞,膽固醇,甘油三脂,脂酰CoA轉(zhuǎn)移酶,

3、羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)還原酶,脂酰輔酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT),,,Y,?,體內(nèi)篩選動物模型(用于降脂藥物篩選及機(jī)制研究),○ 家兔,○ 大鼠,○ 小鼠,○ 金黃地鼠,家 兔,◎ 常用日本大耳兔或新西蘭白兔?！?兔是喂飼富含高膽固醇食物引起高脂血癥和動脈粥樣硬化病變的敏感動物?！?通過調(diào)整飼料可制作內(nèi)源性高脂血癥和外源性高脂血癥模型?！?造模后形成的主動脈斑塊及冠狀動脈粥樣硬化病變與人類相似。,◎

4、 灌胃給藥操作不便，灌胃不當(dāng)易造成死亡?！?高脂血癥模型及動脈粥樣硬化斑塊形成時間較長，耗費飼料，動物成本較高?！?血清中VLDL占總膽固醇的比例過高，且兔為草食動物，其脂代謝與人差異較大?！?因無較為理想的高脂血癥動物模型，目前有關(guān)調(diào)脂新藥和抗動脈粥樣硬化藥物的研究中，家兔仍然是一種常用的實驗動物。,家兔高脂血癥造模,大鼠是目前國內(nèi)研究人類脂質(zhì)代謝使用最多的實驗動物。選用SD大鼠或Wister大鼠造模?！?易于飼養(yǎng)管理，抵抗力

5、較強(qiáng)◎ 給藥容易◎ 采樣方便，血量豐富，便于一次較多指標(biāo)的檢測◎ 在國外高脂血癥研究中，大鼠的使用逐漸減少。 a. 大鼠血清中高密度脂蛋白(HDL)是血漿膽固醇的主要載體。 b. 對抗動脈粥樣硬化形成的能力,大 鼠,◎ 用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠，一般7-10天可形成高脂血癥模型?！?影響因素： a. 飼料中摻人了膽固醇、豬油等油膩的高脂物品，使飼料性質(zhì)發(fā)生改變，有異昧，動物易出現(xiàn)“厭食”；而且不易于掌握精

6、確的飼料用量。 b. 進(jìn)口膽酸納價格昂貴。 c. 高脂乳劑黏稠，不易抽取，灌胃造模時，用量不易準(zhǔn)確控制。 d. 所造模型大多為外源性膽固醇攝入過量所致。,大鼠高脂血癥造模,小鼠在調(diào)血脂藥臨床前研究中應(yīng)用越來越多?！?價格便宜，造模成本低，采樣較方便。高脂飼料喂養(yǎng)可成功建立高脂血癥模型?；蛉睋p和基因敲除小鼠已成功地用于藥理學(xué)研究中。◎ 具有清楚的遺傳背景，繁殖力強(qiáng)，模型穩(wěn)定?！?血脂水平與人類接近，主動脈和

7、冠狀動脈均有明顯的斑塊形成，可用于動脈粥樣硬化的實驗研究?！?apoE基因缺損小鼠及LDL基因敲除小鼠血脂升高不受人為因素影響。,小 鼠,◎ 急性高脂蛋白血癥的可用一種表面活化劑(Triton WR-1 339)給小鼠尾靜脈注射，12～24 h即可誘導(dǎo)出高脂蛋白血癥模型 ，可用作初篩新藥?！?正常小鼠用高脂飼料喂養(yǎng)造模時間長?！?采血量少，指標(biāo)的檢測受限。,小鼠高脂血癥造模,◎ 普通飼料喂養(yǎng)時，成年鼠血清膽固醇水平是正常鼠的5～

8、8 倍?！?當(dāng)給予高脂負(fù)荷飼料(20 %脂肪，0.3 %膽固醇后) ，血清中膽固醇濃度可達(dá)普通飼料喂養(yǎng)升高值的4～5 倍。◎ 血脂升高穩(wěn)定。◎ 遺傳背景為C57BL/6品系?！?繁殖能力較強(qiáng)。,apoE-/-小鼠,◎ 行動靈敏，易發(fā)生逃逸。◎ 性情較其他品系小鼠急，抓持不當(dāng)易被咬傷。◎ 成年雄鼠之間易發(fā)生撕咬。,apoE-/-小鼠,◎ 較好地反映人類膽固醇代謝的調(diào)節(jié)。如肝臟合成膽固醇的比例，人內(nèi)源性膽固醇約有90%是肝外組織

9、合成的，雄性金黃地鼠肝外合成比例約為85%，而雌性大鼠只有35%是肝外合成、雌性小鼠只有55%在肝外合成?！?較低的高脂負(fù)荷即可建立理想的動物模型。飼料中膽固醇含為0.2%即可成功造模。大鼠飼料中膽固醇的含量多為1-2%，超過自身合成量的10倍， 且要在飼料中加入膽汁酸鹽才有能達(dá)到理想的血脂水平?！?建立高脂血癥模型所需時間短。喂飼高脂飼料后3-4周，血TC、TG 可達(dá)較為穩(wěn)定的水平。,金黃地鼠(hamster),降脂中藥的藥理學(xué)研

10、究(一),◎ 脂質(zhì)含量及酶的測定 a. 血脂含量的測定 血清總膽固醇(TC) 血清甘油三酯(TG) 血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C) 血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) b. 血清酶活性測定 羥甲基戊二酰CoA(HGM-CoA)還原酶 肝脂酶(HL) 脂蛋白脂酶(LPL) 卵磷脂膽固醇酯酰轉(zhuǎn)移酶（LCAT）,◎ 載脂蛋白含量的

11、測定 apoAI apoB apoC◎ LDLR活性測定 放射性配基法 酶聯(lián)免疫吸附法 激光共聚焦顯微鏡測定法◎ LDLR基因表達(dá),降脂中藥的藥理學(xué)研究(二),● 動脈粥樣硬化的研究,與動脈粥樣硬化形成有關(guān)的細(xì)胞和分子,Fatty-Streak Formation in Atherosclerosis,Endothelial Dysfunction in Atheroscle

12、rosis,Unstable Fibrous Plaques in Atherosclerosis,Formation of an Advanced, Complicated Lesion of Atherosclerosis,ApoE Knockout Mice,,0 6 12 18 w

13、ks of age,High Fat 0.3% CholesterolT-Chol 1500-1800 mg/dl,Normal ChowT-Chol 500-700 mg/dl,Atherosclerotic Lesion,,,抗動脈硬化中藥的藥理學(xué)研究(一),◎ 血脂的測定◎ 病理形態(tài)學(xué)研究 制作主動脈弓病理切片 染色及斑塊面積的測定，測定斑塊面積用imagepro plus軟件◎ 分子病理學(xué)研究

14、通過免疫組織化學(xué)，用特定的抗體檢測斑塊組織中相關(guān)分子的表達(dá),抗動脈硬化中藥的藥理學(xué)研究(二),◎ 分子生物學(xué)研究 巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)及其受體c-fms的基因表達(dá) 血小板來源的生長因子(PDGF)受體的基因表達(dá) 凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體(LOX-1)的基因表達(dá) 趨化因子(cxcl16、MCP-1及其受體CCR2等),● 血管再狹窄的研究,動物模型,三種小鼠血管再狹窄模型◎ 塑料微導(dǎo)

15、管損傷模型（Cuff 植入模型） ◎ 金屬絲頸動脈損傷模型 ◎ 金屬直彈簧絲股動脈損傷模型,塑料微導(dǎo)管損傷模型,金屬絲頸動脈損傷模型,,,(據(jù)Lindner醫(yī)師等所著論文的圖例部分引用）,金屬直彈簧絲股動脈損傷模型,（據(jù)Sada醫(yī)師等所著論文引用）,C57BL/6Mice(Recipient),,BM cells=5X105,,,,,,,,,,,,Bone Marrow Transplantation,GFP+/LDLR

16、 -/- Mice(Donor),,Irradiation (9Gy),①,②,Polyethylene Cuff,Sham Operation,Left Femoral Artery,Right Femoral Artery,,Mouse Vascular Injury Model,Cuff Placement,Cuff-placed Artery,Sham-operated Artery,Bone Marrow-derived G

17、FP-positive Cells in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion,Anti-Macrophage BM8,Macrophage like Cells in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion,Cuff-placed Artery,Sham-operated Artery,GFP,Merged,Bone Marrow-derived S

18、mooth Muscle Cells in Cuffed Femoral Artery of C57Bl/6 Mice,Anti-a actin(2 weeks),SM1(2 weeks),,Cy3,Anti-a actin(1 week),Cuff-placed Artery,Sham-operated Artery,CD31-positive Cells in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling

19、 Lesion,Bone Marrow-derived ECs in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion,Anti - vWF,1 week,2 weeks,Anti-PDGFRbAnti-c-fmsControl IgG（1mg/day）,9,,,Cuff Placement Day 2,10,Cuff Placement and Administration of anti-c-

20、fms and anti-PDGF-Rb mAb,C57Bl/6 ♀ (8 weeks of Age)　on Normal Chow　Diet,,,,,Sacrifice,,8,Age (wk),Anti-PDGF-Rb treated,Staining of Macrophage and Smooth Muscle cells in Mice Injected with anti-c-fms and anti-PDGF-Rb mAb,

21、Anti-c-fms treated,Immunostained with BM8,Immunostained anti a-actin,Anti-Rat IgG treated,,Distinct Cellular Hierarchy in Atherogenesis and Cuff-mediated Vascular Remodeling,,,,,Endothelial Cell,Smooth Muscle Cell,,,,X

22、,,,,,,,X,Smooth Muscle Cell,Macrophage,Endothelial Cell,,Atherogenesis,,,Cuff-mediated Lesion,Macrophage,Endothelial Cell,Macrophage,Smooth Muscle Cell,GFP,SMC,merged,Bone Marrow-derived Smooth Muscle Cells in Cuff-induc

23、ed Vascular Remodeling Lesion,Scale Bars=100μm,Cuff Placement(1 week),Cuff Placement(2 weeks),Bone Marrow-derived Endothelium Cells in Cuff-induced Vascular Remodeling Lesion,GFP,EC,merged,Scale Bars=100μm,Cuff Plac