李園殺菌劑生物化學(xué)資料資料

1、殺菌劑生物化學(xué)-部分內(nèi)容,李 園010-62815940liyuancaas@126.com,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,2013-10-30,,病原菌對(duì)殺菌劑的抗性機(jī)理,2,,殺菌劑的作用機(jī)理,,殺菌劑混配增效和拮抗機(jī)理,,殺菌劑選擇性作用生化機(jī)制,4,,殺菌劑在環(huán)境或生物體內(nèi)代謝,課程內(nèi)容,第三章 殺菌劑混配增效和拮抗機(jī)理,一 、化學(xué)作用 二、 混劑中的藥物與目標(biāo)生物生理生化過程的相互作用（一）增效作用1 不依賴載體

2、的通透原生質(zhì)膜的擴(kuò)散作用： 2 依賴載體介質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)而通透原生質(zhì)膜 3 向作用位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移 4 活化作用（二）拮抗作用 復(fù)配混劑對(duì)同一種生物的毒力比組成混劑的各藥劑單用毒力之和顯著低時(shí)，稱為拮抗作用。拮抗作用表現(xiàn)在防治效果降低，對(duì)保護(hù)對(duì)象表現(xiàn)藥害減輕。,,例如：多氧霉素和滅瘟素混用，降低多氧霉素對(duì)水稻紋枯病的防治效果。拮抗作用在降低對(duì)被保護(hù)對(duì)象的藥害方面也有很多例子，如硫酸鋅和代森錳混用，可降低代森錳的藥害。銅制劑和鏈

3、霉素混用，減輕鏈霉素對(duì)白菜的藥害。利用這些拮抗作用，可以擴(kuò)大藥劑的應(yīng)用范圍。拮抗機(jī)理：1、對(duì)酶的競(jìng)爭(zhēng)作用2、補(bǔ)償作用,將欲混配的兩種單劑按田間推薦使用劑量進(jìn)行混配，并計(jì)算出兩種單劑的質(zhì)量比。測(cè)定混配后的藥液對(duì)黃瓜白粉病的防治效果，根據(jù)公式計(jì)算出不同藥劑混配后增效系數(shù)，篩選具有增效作用的配比。,,,,第四章 殺菌劑選擇性作用生化機(jī)制,選擇性作用類型：真菌與植物間；不同病害/不同菌系間；對(duì)菌類不同反應(yīng)間；類似化合物的不同

4、結(jié)構(gòu)之間；不同藥劑間；藥劑的不同作用點(diǎn)之間的選擇性。,一、內(nèi)吸殺菌劑在病菌和植物之間的選擇性1、藥劑作用點(diǎn)或接受點(diǎn)之間的不同2、藥劑作用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)組分不同3、藥劑對(duì)生物合成的干擾在病菌和植物的影響不同4、藥劑所影響的酶類在含量上或活性上在菌類和植物中有很大的不同 5、抑制病菌的致病力或降低其毒力的藥劑對(duì)植物生長(zhǎng)完全沒有影響 6、植物抗病誘導(dǎo)劑,二、內(nèi)吸殺菌劑對(duì)不同菌之間的選擇性1、病菌體內(nèi)藥劑接受點(diǎn)或藥劑作用系統(tǒng)

5、的不同萎銹靈對(duì)擔(dān)子菌：呼吸鏈上復(fù)合物Ⅱ處的電子傳遞，QPs蛋白質(zhì)子囊菌或霜霉菌：復(fù)合物Ⅱ處缺乏QPs蛋白質(zhì)，因而對(duì)該藥不敏感。2、藥劑吸收量的不同或藥劑在細(xì)胞內(nèi)累積量的不同在非內(nèi)吸殺菌劑中較為明顯3、鈍化和強(qiáng)化藥物能力的不同 4、藥劑作用系統(tǒng)或作用點(diǎn)在不同菌體中對(duì)生命力影響程度不同,（一）、保護(hù)性殺菌劑1、無機(jī)銅殺菌劑防治小麥腥黑穗病、葡萄霜霉病等多種作物病害。代表藥劑：波爾多液、硫酸銅、氫氧化銅、氧化亞銅等。作

6、用機(jī)制：殺菌、抑菌效果歸因于銅離子。表現(xiàn)為：1）與菌體細(xì)胞膜上含巰基的酶作用，使酶失去活性。2）與細(xì)胞膜表面的鈣、鎂、鉀等陽(yáng)離子交換，影響菌體細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的活性。3）局部深入菌體內(nèi)與某些酶結(jié)合，影響其活性。,2、無機(jī)硫殺菌劑石硫合劑防治白粉病代表藥劑：石硫合劑、硫磺、膠體硫作用機(jī)制：對(duì)靶標(biāo)菌的毒力作用主要?dú)w因于硫離子和少量硫化氫氣體對(duì)病原菌的殺菌和抑菌效果，是菌體細(xì)胞的呼吸抑制劑，作用于：1）病原菌細(xì)胞色素b和c之間的氧

7、化還原體系之間的電子傳遞過程；2）阻礙菌體內(nèi)三羧酸循環(huán)中的琥珀酸的氧化。,3、有機(jī)硫殺菌劑防治果樹、蔬菜霜霉病、白粉病、炭疽病等。代表藥劑：“福美”類、“代森”類等二硫代氨基甲酸衍生物“福美”類作用機(jī)制：抑制一些酶的活性，干擾三羧酸循環(huán)。在菌體內(nèi)代謝為含硫氰基（-N=C=S）的化合物，硫氰基使病原菌細(xì)胞體內(nèi)氨基酸和酶的巰基失活，最終抑制這些物質(zhì)的合成和功能?！按鳖愖饔脵C(jī)制：表現(xiàn)為1）破壞了輔酶A，直接影響了需要有輔酶A參

8、與的脂肪酸的β氧化，丙酮酸脫氫酶系、α-酮戊二酸脫氫酶系的活性；2）抑制以銅、鐵為輔基的酶的活性。,4、取代苯類殺菌劑對(duì)立枯絲核菌有特效，對(duì)甘藍(lán)根腫病菌、白絹病菌、馬鈴薯瘡痂病菌、油菜菌核病菌、放線菌均有防效。對(duì)腐霉菌、疫霉菌、鐮刀菌、輪枝菌等土傳病菌防效差。代表藥劑：五氯硝基苯、百菌清作用機(jī)制：五氯硝基苯影響菌體細(xì)胞有絲分裂。百菌清能與真菌細(xì)胞中的3-磷酸甘油醛脫氫酶發(fā)生作用，與該酶體中含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞酶的活力，

9、使真菌細(xì)胞的呼吸代謝受到破壞而喪失生命力。,5、酰亞胺類殺菌劑對(duì)灰霉孢屬、核盤菌屬、葡萄孢屬、鏈格孢屬、絲核菌屬真菌有特效。代表藥劑：異菌脲、腐霉利、乙菌利、乙烯菌核利作用機(jī)制：這類藥劑能夠抑制含有-NH2和-SH的重要物質(zhì)，如氨基酸和酶的合成，對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁也有影響，改變膜的滲透性和功能。此外，異菌脲也能抑制蛋白激酶，控制一些細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞。,腐霉利（procymidone）,乙烯菌核利（vinclozolin）,異菌脲（i

10、prodione）,（二）、內(nèi)吸性殺菌劑1、羧酰替苯胺類防治大麥及小麥的散黑穗和銹病。代表藥劑：萎銹靈、氧化萎銹靈、拌種靈、麥銹靈作用機(jī)制：該類殺菌劑為呼吸抑制劑。可在真菌細(xì)胞中有選擇性地積累，最終抑制線粒體呼吸中重要的琥珀酸脫氫酶的活性。對(duì)孢子萌發(fā)不產(chǎn)生完全抑制作用，而是延緩了孢子萌發(fā)的時(shí)間，抑制芽管的伸長(zhǎng)。,2、苯并咪唑類對(duì)大多數(shù)子囊菌、半知菌、擔(dān)子菌引起的病害有特效，但對(duì)半知菌中的交鏈孢、長(zhǎng)蠕孢、輪枝孢引起的病害效果

11、差，對(duì)細(xì)菌和卵菌無效。代表藥劑：多菌靈、苯菌靈、硫菌靈、甲基硫菌靈作用機(jī)制：苯并咪唑類作用方式與秋水仙素十分相似，在病原物細(xì)胞分裂過程中，藥劑可與紡錘絲的β-微管蛋白相結(jié)合，干擾細(xì)胞核有絲分裂，導(dǎo)致真菌細(xì)胞內(nèi)染色體加倍。作用位點(diǎn)單一，選擇性較強(qiáng)，病原菌易產(chǎn)生抗藥性。,3、有機(jī)磷類防治稻瘟病，對(duì)水稻菌核病、紋枯病、玉米大小斑病也有效，對(duì)絲核菌、灰霉菌、核盤菌、青霉菌、霜霉病菌、疫霉菌、白粉菌效果好。代表藥劑：稻瘟凈、甲基立枯磷

12、、乙膦鋁、三乙膦酸鋁作用機(jī)制：稻瘟凈主要通過影響細(xì)胞膜上的卵磷脂合成過程的甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞壁合成的影響。甲基立枯磷殺菌作用機(jī)制是抑制DNA、RNA、蛋白質(zhì)的生物合成及氧的吸收。三乙膦酸鋁對(duì)靶標(biāo)病原菌除直接的抑菌作用外，還可能通過誘導(dǎo)寄主植物體內(nèi)產(chǎn)生酚類、倍半萜類物質(zhì)，增強(qiáng)寄主抗病能力。,4、酰苯胺類對(duì)卵菌中腐霉屬、疫霉屬、霜霉病菌有特效。代表藥劑：苯霜靈、甲霜靈、呋霜靈、甲呋酰胺等。作用機(jī)制：抑制rRNA

13、聚合酶的活性，從而抑制了rRNA的生物合成。表現(xiàn)出菌體細(xì)胞壁加厚，影響病原菌侵入后菌絲在寄主植物體內(nèi)的發(fā)育，對(duì)孢子囊的萌發(fā)沒有影響。,5、三唑類對(duì)各種銹病、白粉病、麥類根腐病、黑穗病、葉枯病、全蝕病效果好，對(duì)子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌均有一定效果，對(duì)卵菌無活性。代表藥劑：三唑酮、三唑醇、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑、丙環(huán)唑、乙環(huán)唑、戊唑醇等。作用機(jī)制：三唑類化合物的含氮雜環(huán)部分的氮與細(xì)胞色素P-450的鐵離子結(jié)合，抑制麥角甾醇的生物合成，破

14、壞菌體細(xì)胞膜功能。三唑類化合物影響了植物中赤霉素的合成，具有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用。,6、甲氧基丙烯酸酯類對(duì)小麥葉枯病、網(wǎng)斑病、云紋病、白粉病等效果顯著。代表藥劑：嘧菌酯、唑菌胺酯、醚菌酯、肟醚菌胺、苯醚菌酯等。作用機(jī)制：甲氧基丙烯酸酯類為線粒體呼吸抑制劑，藥劑與線粒體電子傳遞鏈中復(fù)合物III（Cytbc1復(fù)合物）結(jié)合，阻斷電子從Cytbc1復(fù)合物流向Cytc，阻止ATP合成，干擾真菌細(xì)胞的呼吸作用，破壞能量形成，從而抑制靶標(biāo)病

15、原菌生長(zhǎng)或殺死病原菌。,7、羧酸氨基化合物類殺菌劑對(duì)多數(shù)卵菌植物病原菌，如霜霉屬、疫霉屬病菌效果顯著。代表藥劑：烯酰嗎啉、氟嗎啉、異丙菌胺、雙炔酰菌胺等。作用機(jī)制：尚未明確。研究表明，該類殺菌劑對(duì)游動(dòng)孢子的釋放和游動(dòng)沒有抑制作用，對(duì)細(xì)胞壁的所有階段均具有明顯的抑制作用，推測(cè)可能影響細(xì)胞壁物質(zhì)的合成。,（三）植物誘導(dǎo)抗病激活劑作為植物誘導(dǎo)抗病激活劑的殺菌劑自身并無殺菌或抑菌活性，但可作為植物免疫系統(tǒng)的激活劑（Elicitor

16、），能在DNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控特殊代謝相關(guān)基因的表達(dá)及PR蛋白的產(chǎn)生，激發(fā)植物啟動(dòng)自身的防御系統(tǒng)，以抵抗病原菌的侵染。這種現(xiàn)象通常稱為植物誘導(dǎo)抗病性（induced resistance），包括局部誘導(dǎo)抗病性和系統(tǒng)獲得抗性（SAR）。系統(tǒng)獲得抗性是植物病害防治研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容，指植物經(jīng)局部誘導(dǎo)后，在侵染點(diǎn)產(chǎn)生的抗病信號(hào)可傳播至其他非誘導(dǎo)部位而使植物產(chǎn)生抗病性的現(xiàn)象。,Mode of action - Actigard,Inductio

17、n of Systemic Acquired Resistance,1、烯丙異噻唑（PBZ）作用機(jī)制：具有內(nèi)吸傳導(dǎo)作用，誘導(dǎo)水稻植株體內(nèi)產(chǎn)生α-亞麻酸。亞麻酸是茉莉酸的前體，而茉莉酸是植物抗病反應(yīng)中的重要信號(hào)分子，可增強(qiáng)與植物抗病性相關(guān)的酶的活性，并使侵染部位寄主細(xì)胞形成了類木質(zhì)素的保護(hù)屏障。,2、苯并噻二唑（BTH)代表產(chǎn)品：苯并噻二唑-7-硫代羧酸甲酯，中文通用名為活化酯（acibenzolar）。典型植物誘導(dǎo)激活劑，

18、發(fā)病早期施用，對(duì)多種真菌、細(xì)菌病害產(chǎn)生防御作用，尤其是對(duì)白粉病、銹病、霜霉病效果顯著。,作用機(jī)制：具有較強(qiáng)內(nèi)吸傳導(dǎo)作用，通過根部施藥可迅速被植物吸收和傳導(dǎo)到植株各個(gè)部位，激活植物的免疫系統(tǒng)，使其表現(xiàn)為“系統(tǒng)獲得抗性”。可誘導(dǎo)植物體內(nèi)病程相關(guān)PR蛋白的產(chǎn)生，苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、過氧化物酶等一系列防御酶系活性的提高，以及木質(zhì)素和酚類物質(zhì)含量的提高。包括使植物細(xì)胞產(chǎn)生乳狀突起、形成胼胝質(zhì)等。,3、寡糖真菌病原Pm

19、g（Phytophthora megasperma f.sp.glycinea）的菌絲體壁上分離到帶分枝的β-1,3和β-1,6連接組成的葡聚七糖是首次被發(fā)現(xiàn)的寡糖激活劑。作用機(jī)制：寡糖可誘導(dǎo)植保素、蛋白酶抑制劑的合成以及與病程相關(guān)PR蛋白的積累，并可使苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶等多種防御酶系活性增強(qiáng)。,（四）殺菌農(nóng)用抗生素是指由細(xì)菌、真菌或放線菌等微生物產(chǎn)生的可以在較低濃度下殺死或抑制植物病原菌的次生代謝產(chǎn)物。作用位點(diǎn)單一

20、，大多是蛋白質(zhì)合成抑制劑，靶標(biāo)病原菌易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，不宜單一長(zhǎng)期使用。,1、春雷霉素：水溶性內(nèi)吸性抗生素，對(duì)稻瘟病、甜菜葉斑病、番茄葉霉病等真菌病害及黃瓜角斑病、蘋果炭疽病等細(xì)菌性病害都有良好的防效。作用機(jī)制：微生物蛋白合成抑制劑，通過氨酰-RNA與核糖體30S小亞基及70S大亞基結(jié)合抑制蛋白質(zhì)合成，抑制菌絲生長(zhǎng)。,2、多抗霉素：水溶性內(nèi)吸性殺菌抗生素，對(duì)多種真菌病害，尤其是對(duì)交鏈孢菌引起的梨黑斑病、蘋果斑點(diǎn)落葉病、灰葡萄孢引起的

21、灰霉病防效好。作用機(jī)制：干擾病原菌細(xì)胞壁（幾丁質(zhì)）合成，阻止病菌產(chǎn)生孢子和病斑擴(kuò)大。,3、井岡霉素：水溶性抗生素，對(duì)立枯絲核菌引起的病害效果顯著，對(duì)水稻紋枯病有特效。作用機(jī)制：是立枯絲核菌AG-1海藻糖酶的抑制劑，能有效阻止紋枯病菌從菌絲的基部向頂端輸送營(yíng)養(yǎng)（如葡萄糖），從而抑制菌絲的生長(zhǎng)和發(fā)育。,,4、武夷菌素：1979年從福建省武夷山區(qū)采土分離出來的鏈霉菌。對(duì)黃瓜、花卉白粉病有明顯的防治效果，對(duì)番茄灰霉病、葉霉病、小麥白

22、粉病也有效。作用機(jī)制：能抑制菌絲蛋白質(zhì)的合成，使細(xì)胞膜破裂，原生質(zhì)滲漏。,第五章 殺菌劑在環(huán)境或生物體內(nèi)的代謝,一、前言殺菌劑代謝——?dú)⒕鷦┦苌矬w內(nèi)多種因素或自然環(huán)境條件的影響而改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)的過程發(fā)生的變化涉及藥效、毒性和對(duì)環(huán)境的影響殺菌劑使用后的變化： 一是無酶參與的純化學(xué)分解（自然水解、氧化） 二是發(fā)生在有機(jī)體（植物、動(dòng)物、微生物）代謝系統(tǒng)、由酶催化的生化反應(yīng)。包括氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、水解作用及結(jié)合物的形成,

23、根據(jù)代謝后的活性/毒性變化分：1、失活代謝藥劑本身有活性，代謝后活性降低，或完全失效 。（多數(shù)） 2、活化代謝 藥劑離體時(shí)無殺菌活性，使用后代謝成有殺菌或抑菌活性的物質(zhì)。 如：敵枯唑、稻枯磷、立枯靈、抑菌嗪酮、托布津、苯來特、三唑酮等3、增毒代謝 對(duì)高等動(dòng)物而言，大多數(shù)藥劑的代謝最終變成無毒無害物質(zhì)，但有的仍然保持相當(dāng)?shù)亩拘裕蛘咦兂啥拘愿叩奈镔|(zhì)，甚至致畸致癌，污染環(huán)境、危害人類。如：代森類,二、各類殺菌

24、劑的代謝途徑,殺菌劑在生物體或環(huán)境中的不同反應(yīng)途徑： a: 動(dòng)物；b: 細(xì)菌；e: 酶；f: 真菌；l: 光；p: 植物；s: 土壤；w: 水1、苯并咪唑類 苯來特和多菌靈（MBC）苯來特在溶液、微生物培養(yǎng)物、土壤、動(dòng)植物體內(nèi)脫去丁基氨基甲?；鶊F(tuán)，形成多菌靈（MBC），但速度不同還可產(chǎn)生正丁胺及CO2正丁胺在大豆中能誘導(dǎo)羥基菜豆朊的生成羥基菜豆朊對(duì)植物有毒,2、托布津類甲基托布津及乙基托布津 環(huán)

25、化作用/關(guān)環(huán)反應(yīng)?多菌靈及乙基多菌靈轉(zhuǎn)化條件：光、鄰苯醌、MFO3、丁烯酰胺類 萎銹靈及氧化萎銹靈動(dòng)植物、土壤中：萎銹靈?亞砜的衍生物 （萎銹靈亞砜）?砜的衍生物（氧化萎銹靈）氧化萎銹靈毒性不及萎銹靈，但對(duì)銹菌的毒性比萎銹靈高，對(duì)黑粉菌特效 。,4、有機(jī)磷類（1）定菌磷 ? PP-定菌靈（活化）（2）異稻瘟凈?二異丙基磷酸酯（活化）5、嘧啶類（1）甲菌定和乙菌定 N-脫羥基作用，丁基羥基化，形成結(jié)合

26、物（2）抑菌嗪酮 ? 6-氮雜尿嘧啶（活化）,6、三唑類（1）三唑酮及三唑醇三唑酮 ?三唑醇影響活性因素：A 轉(zhuǎn)化程度；B三唑醇對(duì)映體組成；C 失活代謝過程；D 真菌對(duì)三唑醇單個(gè)對(duì)映體的敏感性7、代森類乙撐硫脲（ETU），致畸、致癌、阻礙甲狀腺功能在動(dòng)物體內(nèi)，能很快排出體外土壤及植物體內(nèi)，能很快轉(zhuǎn)化成2-咪唑啉和乙撐脲8、有機(jī)氯類地茂散、菌核利,1.苯并咪唑類殺菌劑的代謝⑴苯菌靈(苯來特)

27、和多菌靈,三、殺菌劑代謝途徑詳解,⑵涕必靈和麥穗寧,2、托布津類,3、丁烯酰胺類及有關(guān)化合物⑴萎銹靈及氧化萎銹靈,⑵滅銹胺,⑶2，5－二甲基—3—呋喃甲酰替苯胺,⑷比銹靈,4、有機(jī)磷酸酯類⑴定菌磷,⑵克瘟散,5、嘧啶類及有關(guān)化合物 ⑴甲菌定和乙菌定,⑵丁嘧酯 ⑶十三嗎啉(克啉菌),⑷嗪胺靈,⑸抑菌嗪酮、卵菌靈和胺丙威,6、三唑類⑴三唑酮,影響三唑酮離體活性的有：①三唑酮轉(zhuǎn)化為三唑醇的程度；②三唑醇對(duì)映體的定性和定量組成；

28、③失活代謝過程；④真菌對(duì)三唑醇單個(gè)對(duì)映體的敏感性。根據(jù)真菌對(duì)三唑酮的代謝和敏感性的相互關(guān)系，可把一些真菌分為三種類型：(Ⅰ)對(duì)三唑酮和三唑醇均敏感；(Ⅱ)對(duì)這兩種化合物均不敏感；(Ⅲ)對(duì)三唑酮不敏感，但對(duì)三唑醇中等敏感。,⑵烯唑醇,7、代森類,8、有機(jī)氯類⑴稻瘟酞,⑵地茂散,Thank you!,分子克隆的基本操作技術(shù),體外 剪切、拼接、重組,轉(zhuǎn)化 基因重組體（recombinant DNA）,基因產(chǎn)物,,,,目的基因的

29、獲得,PCR技術(shù),酶切，連接策略,轉(zhuǎn)化技術(shù)，目的重組子的篩選,高效表達(dá)方法,,,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction,PCR):一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法,又稱為基因的體外擴(kuò)增法。1985年 美國(guó)Cetus公司 Mullis等人開發(fā)1993年 Mullis 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),目的基因的獲得和序列分析,PCR 的反應(yīng)體系,模板DNA（template）引物（primer）:與被分離的目

30、的基因的DNA雙鏈兩 端序列相互補(bǔ)的DNA，約20個(gè)堿基左右；TaqDNA 聚合酶／pfu高保真聚合酶；dNTP緩沖液（buffer）（PCR增強(qiáng)劑）一般PCR反應(yīng)可擴(kuò)增出100—5000bp的目的基因,PCR基本反應(yīng)過程,1，變性 95℃，雙鏈解開成單鏈2，退火 55℃左右，引物配對(duì)3，延伸 72℃，合成新鏈30個(gè)循環(huán)左右,PCR 的目的?,引物的設(shè)計(jì),1、引物長(zhǎng)度（primer length）

31、 常用的是18-24 bp，不要大于38bp，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。,2. 引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。 另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫

32、度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。 若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引 物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。,3. 引物3′端不能選擇A，最好選擇T。 引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所

33、以3′端最好選擇T。,4. 堿基要隨機(jī)分布 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。,5. 引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。 引物的5′ 端決定著PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度，它對(duì)

34、擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。 引物5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。 引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。,給酶切位點(diǎn)添加保護(hù)堿基,限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識(shí)別位點(diǎn)兩邊的若干個(gè)堿基，這些堿基對(duì)內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很

35、大影響的，被稱為保護(hù)堿基。保護(hù)堿基常見于PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)，為保護(hù)5` 端外加的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，使酶切完全而添加。 其次，在分子克隆時(shí)，選擇載體的酶切位點(diǎn)也會(huì)碰到，相臨的2個(gè)酶切位點(diǎn)往往不能同時(shí)使用，因?yàn)橐粋€(gè)位點(diǎn)切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點(diǎn)切割。,6. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而

36、影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3′ 端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。,7. 引物應(yīng)具有特異性 引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)了。,各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC

37、含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。,My protocol ?,My protocol ?,Bio-rad MJ researcher (2 block):S1: 95℃, 5’, (95℃ 45’’,

38、60℃ 1’ , 72℃ 2’)×30, 72℃ 10’, 4℃ forever : 1KbS2: 95℃, 5’, (95℃ 1’’, 60℃ 90’’ ,72℃ 4’) ×35, 72℃ 10’, 4℃ forever : 2 KbS3: 95℃, 5’, (95℃ 45’’, 60℃ 1’ , 72℃ 3’) ×30, 72℃ 10’, 4℃ forever : 1.4 Kb(extensio

39、n time=2 × DNA size),另外幾種PCR介紹,巢式PCR（Nest-PCR）遞減PCR（TouchDown PCR）重疊PCR （overlap PCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR （RT-PCR）,巢式PCR（Nest-PCR）,,,巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5' RACE

40、）的特異性。,遞減 PCR（TouchDown PCR）,遞減PCR通過在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低1-2℃,直到退火溫度低于Tm 5℃。,特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。,遞減PCR對(duì)于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。,重疊PCR （over-lap PCR）,

41、將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來。此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。,逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）,由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA