偶氮染料的生物毒性及其與生物大分子的結(jié)合作用.pdf

1、染料的毒性，特別是偶氮染料的致毒作用，已經(jīng)引起各國政府的高度關(guān)注。如何快速評價偶氮染料對生態(tài)環(huán)境的毒性效應(yīng)，減少其對環(huán)境及人類的危害，已成為急待研究的課題。染料分子可通過多種途徑被人體吸收，并引起某種生物學作用。特別是在靶部位與關(guān)鍵性生物大分子的結(jié)合，可引起生物大分子各種結(jié)構(gòu)和功能的異常，而發(fā)生毒負作用。近年來，關(guān)于污染物不良效應(yīng)的研究，已經(jīng)深入到以生物大分子作為污染物作用的靶位點，從而使人們對于污染的認識及其評價更為明確，也為污染物的

2、防治提供更為科學的依據(jù)。本論文從兩個層面對三種偶氮染料的毒性進行了研究。用發(fā)光細菌法評價了它們的急性毒性，并對致毒的機理進行了研究。通過三種染料與人血清白蛋白的結(jié)合機理和與DNA結(jié)合模式、親和力大小以及對DNA堿基序列特異性識別的研究，預測其對人類潛在的危害。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.利用發(fā)光菌法評價了三種偶氮染料的急性毒性，應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)測定了染料作用前后發(fā)光細菌體內(nèi)生物大分子特征拉曼位移，并對發(fā)光菌與C.I.酸性

3、紅73接觸前后特征拉曼位移的變化進行了詳細指認。實驗表明，在所測試的濃度范圍內(nèi)三種偶氮染料均有一定的毒性。其毒性從大到小的順序是：C.I.酸性紅73>C.I.酸性藍113>C.I.活性紅24。其中，C.I.酸性紅73毒性最大，當濃度為100 mg/L，與發(fā)光細菌作用15分鐘后，其發(fā)光擬制率為26.9％，毒性大小相當于氯化汞濃度為0.061mg/L時毒性，并隨作用時間的延長，毒性增加。拉曼光譜也表明，三種偶氮染料和發(fā)光菌接觸后，與其生物大

4、分子發(fā)生了結(jié)合，或者使這些生物大分子所處的微環(huán)境發(fā)生了變化，導致了其特征拉曼峰的強度和位置發(fā)生不同程度的改變，影響到發(fā)光菌正常的生理代謝功能，表現(xiàn)在發(fā)光強度的降低。
　　 2.應(yīng)用分子對接技術(shù)，研究了還原黃素單核苷酸(FMNH2)與菌熒光素酶的最佳結(jié)合部位位點。完成了FMNH2和熒光素酶三個區(qū)域(即α亞基、β亞基和兩個亞基的交界面處)的分子對接研究。根據(jù)FMNH2與菌熒光素酶每個區(qū)域的的最低結(jié)合能，識別了兩個活性位點，一個在α亞

5、基，命名為活性位點Ⅰ(activesite-Ⅰ)，這個活性位點與已報道的大量實驗結(jié)果是一致的。另一個是在兩個亞基交界面處，命名為活性位點Ⅱ(active site-Ⅱ)。FMNH2在這兩個活性部位的最低結(jié)合能分別為：-32.4 KJ mol-1(活性位點Ⅱ)和-31.2 KJ mol-1(活性位點Ⅰ)，表明兩個活性位點具有近似的親合力?；钚晕稽cⅡ的提出，有助于理解為什么雜二聚體的催化活性高于單個亞基的催化活性；為研究化學污染物對細菌發(fā)光

6、抑制機理提供理論依據(jù)；也為基因突變研究和分子動力學模擬提供一些基礎(chǔ)信息。
　　 3.應(yīng)用分子對接技術(shù)，完成了細菌催化發(fā)光反應(yīng)的底物長鏈脂肪醛和三種染料在熒光素酶兩個活性位點的分子對接模擬，計算出每種物質(zhì)在兩個活性位點的最低結(jié)合能。通過對比結(jié)合能的大小，分析了三種染料抑制細菌發(fā)光的分子機制。分子對接實驗表明，C.I.酸性紅73與底物黃素單核苷酸相比，在兩個活性位點都不具備競爭優(yōu)勢，但是能抑制底物長鏈脂肪醛在兩個活性位點的結(jié)合，應(yīng)具

7、有較強的細菌發(fā)光抑制效應(yīng)。而C.I.酸性藍113和C.I.活性紅24在活性位點Ⅰ都具有較強的親和力，能抑制酶與兩種底物在活性位點Ⅰ的結(jié)合；但是在活性位點Ⅱ的的親和力較差，結(jié)合能均為正值，而不能抑制它們在活性位點Ⅱ的結(jié)合，對細菌的發(fā)光抑制率應(yīng)較小。這與細菌發(fā)光抑制實驗得到的結(jié)果是一致的。
　　 4.應(yīng)用熒光光譜、紫外光譜、園二色譜和分子對接技術(shù)，研究了三種染料與人血清白蛋白結(jié)合的分子機理。理論和實驗研究的結(jié)果表明，三種染料與蛋白質(zhì)

8、之間具有較高的親和力，能自發(fā)結(jié)合形成配合物。疏水作用是主要的作用力類型，而氫鍵和靜電作用對于形成穩(wěn)定的染料-蛋白質(zhì)復合物也起到重要作用。另外染料與白蛋質(zhì)的結(jié)合還誘導蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了微弱變化。
　　 分子對接的結(jié)果顯示，兩種酸性染料C.I.酸性紅73和C.I.酸性藍113與蛋白質(zhì)最可能的結(jié)合位點在蛋白質(zhì)第一結(jié)構(gòu)域的Ⅰ B亞域；給體(Trp214)與受體(染料)之間的平均距離分別為3.06和2.82 nm，與實驗得到的結(jié)果3.

9、28 nm(C.I.酸性紅73)和2.78(C.I.酸性藍113)是非常接近的。而活性染料C.I.活性紅24主要結(jié)合在蛋白質(zhì)第二結(jié)構(gòu)域的Ⅱ A亞域；Trp214與C.I.活性紅24之間的平均距離為1.18 nm，而通過Forster能量轉(zhuǎn)移理論求得的作用距離為3.11 nm，二者存在一定的誤差?？赡艿脑蚴牵?1)C.I.活性紅24分子中含有較多的活性基團，包括帶負電的三個磺酸基(-SO3)、兩個氯原子(-Cl)和一個羥基(-OH)，帶

10、正電的仲胺和一個三嗪環(huán)，這些活性基團使的該染料分子易與蛋白質(zhì)的堿性或酸性氨基酸結(jié)合，而不能進入所研究的四個結(jié)合位點；(2)亞域ⅡA是C.I.活性紅24最佳的結(jié)合位點，但是仍會有部分染料分子結(jié)合在其它幾個亞域。通過Forster能量轉(zhuǎn)移理論求出的作用距離應(yīng)為C.I.活性紅24的各結(jié)合位點與蛋白質(zhì)色氨酸殘基(Trp214)之間距離的平均值；其它原因需要做進一步研究。
　　 研究結(jié)果表明，三種染料中，C.I.酸性紅73與蛋白質(zhì)具有最低

11、的結(jié)合自由能△G(實驗值)和最大的結(jié)合常數(shù)Kb，這與其具有最大的生物毒性(抑制細菌發(fā)光)是一致的。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，可能會影響到生物體內(nèi)重要物質(zhì)的儲存和運輸，與它們形成競爭，干擾正常的生理功能，導致生物毒性的發(fā)生。所以，通過研究染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，計算它們結(jié)合力的大小和結(jié)合位點，來預測它們的生物毒性是可行的。
　　 5.應(yīng)用分子對接技術(shù)，研究了這三種染料與9個DNA片段的結(jié)合模型和對DNA序列的選擇性。分子對接結(jié)果表明，小溝槽

12、結(jié)合是三種染料與正常的DNA片段(沒有插入縫隙)結(jié)合的主要結(jié)合模式。即使DNA片段中存在插入縫隙，小溝槽結(jié)合也可能是部分染料的優(yōu)先結(jié)合模式。在研究的九個不同堿基序列的DNA片段中，十二聚體d(CGCGATATCGCG)2(PDB ID：1DNE)是酸性紅C.I.73最佳的結(jié)合對象，具有最低的結(jié)合自由能(-9.19 kcal/mol.)；六聚體d(CGATCG)2(PDBID：123F)是C.I.酸性藍113最佳的結(jié)合靶標，具有最低的結(jié)合

13、自由能(-11.8kcal/mol.)；含有兩個插入縫隙的四聚體d(CGCG)，(PDB ID：1D32)的小溝槽是C.I.活性紅24最佳的結(jié)合靶標，具有最低的結(jié)合自由能(-8.13 kcal/mol)。結(jié)合模型分析表明，三種染料中，只有C.I.酸性紅73分子中的萘二磺酸部分對DNA小溝槽的CG堿基序列具有選擇性，而其它兩種染料沒有明顯地表現(xiàn)出堿基序列的選擇性。
　　 研究表明，三種染料與DNA的親合力大小跟與小溝槽結(jié)合的芳香基

14、團的數(shù)目有關(guān)，芳環(huán)越多親合力越大。由于C.I.酸性藍113比其它兩種染料具有更多的芳香基團與小溝槽結(jié)合，能與DNA小溝槽形成更大的π鍵堆積。所以除了一個十二聚體d(CGCGATATCGCG)2(PDB ID：1DNE)外，C.I.酸性藍113與其它8個DNA片段的結(jié)合，都具有最強的結(jié)合能力。這是否表明該種染料具有較強的基因毒性，還需要做更深入的研究。DNA大溝槽是結(jié)合蛋白質(zhì)的場所，研究發(fā)現(xiàn)，有部分構(gòu)象的染料分子結(jié)合在DNA大溝槽中。如果