免疫分析中的干擾與消除

1、免疫分析中的干擾與消除,靳增明2010-6-12,內(nèi)容概要,1.概述2.主要內(nèi)容3.結(jié)語,,1.溶血等常見內(nèi)源性干擾2.類風(fēng)濕因子3.補體4.異嗜性抗體5.HAMA6.自身抗體7.結(jié)合蛋白8.其他干擾因素,概述,基礎(chǔ)、前沿的話題普遍、常見的現(xiàn)象復(fù)雜、多樣的本質(zhì)深刻、直接的影響長遠(yuǎn)、艱巨的任務(wù),定義,IFCC：樣本中被分析物質(zhì)外存在的因素，產(chǎn)生的檢測信號，表現(xiàn)在檢測結(jié)果上的系統(tǒng)性錯誤。分

2、析物不相關(guān)的因素 溶血、脂血、抗凝樣本、樣本保存等分析物相關(guān)的因素 類風(fēng)濕因子，異嗜性抗體，自身抗體等,免疫分析中干擾的分析,不同次檢驗結(jié)果的對比的不一致性檢驗結(jié)果與臨床癥狀不符系列檢驗結(jié)果的矛盾極度偏離，難以置信的檢驗結(jié)果稀釋回收高度偏離預(yù)期與其他檢驗試劑或方法相背離的結(jié)果,常見“干擾”因素,溶血高膽紅素脂血（對脂溶性物質(zhì)的干擾，NEFA）抗凝樣本（添加劑，分離膠）樣本的穩(wěn)定性與

3、保存條件,內(nèi)源性激素結(jié)合蛋白,白蛋白TBG，SHBG，CBGFDH（家族性異常白蛋白高甲狀腺素血癥 ）游離激素的測定 （標(biāo)記抗原，標(biāo)記抗原類似物，標(biāo)記抗體）,內(nèi)源性抗體等干擾因素,類風(fēng)濕因子、補體、溶菌酶、異嗜性抗體，HAAA等10%以上（30-40%）的病人體內(nèi)存在內(nèi)源性異嗜性抗體（CAP）10%-40%的人群存在HAMA干擾，取決于檢測試劑（Larry Kricka, President, AACC）我

4、國臨床醫(yī)療總誤診率為27.8%，比國際平均臨床醫(yī)療總誤診率25%高2.8個百分點，其中惡性腫瘤誤診率為40%（2008），抗體干擾是其中原因之一。,異嗜性抗體產(chǎn)生的途徑,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎流行性感冒過敏輸血自身免疫疾病免疫抑制藥物心肌病變注射疫苗,動物接觸（飼養(yǎng)寵物）特定食物（奶酪）動物輔助治療（胸腺細(xì)胞，胚胎細(xì)胞，羊細(xì)胞）血液透析母嬰傳遞腸胃炎（E.coli）,類風(fēng)濕因子（Rheumatoid factors，RF

5、）,自身抗體，體內(nèi)產(chǎn)生的以變性IgG（一種抗體）為抗原的一種抗體 ，通常為IgM，結(jié)合IgG的FC片段。約90%類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的RF呈陽性，在其他自身免疫疾病中也有一定的陽性率。正常人有5%左右的陽性率,類風(fēng)濕因子（Rheumatoid factors，RF）,去除 Fc片段，用F（ab）2替代完整的IgG熱變性IgG處理檢驗抗原時，加入2-巰基乙醇使RF降解。,類風(fēng)濕因子（Rheumatoid factor

6、s，RF）,IgM測定方法：捕獲包被和中和IgG,補體（Complement）,存在于正常人和動物血清與組織液中的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)。 約占血清球蛋白總量的10％。極不穩(wěn)定，大部分對熱敏感，56℃30分鐘即失去活性。 結(jié)合IgG的Fc片段，封閉結(jié)合位點。新鮮血清中的補體對試劑反應(yīng)干擾較大除熱滅活外，可用EDTA稀釋標(biāo)本緩解補體的影響。亦有推薦在試劑中加入雞IgG的，以抑制補體激活,溶菌酶（Lysozyme

7、）,一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶 ，廣泛存在于人體多種組織中，鳥類和家禽的蛋清、哺乳動物的淚、唾液、血漿、尿、乳汁等體液以及微生物中 強烈結(jié)合低等電點蛋白，可橋接固相和標(biāo)記抗體導(dǎo)致假陽性?？杉尤脬~離子，形成絡(luò)合物可在試劑中加入卵清蛋白（pI=4.9）鳥蛋白（beckman）,異嗜性抗體（Heterophilic antibodies，HA）,HA是存在于人類血清中，由已知或未知的抗原物質(zhì)刺激人體產(chǎn)生的，與嚙齒類動物（

8、如鼠等）Ig（s）結(jié)合的一類抗體。通常是由于直接接觸動物，污染的食品，接種動物血清或疫苗而產(chǎn)生?？煞譃樘烊豢贵w和自身免疫抗體，親和力低，結(jié)合力弱，具有廣泛的特異性，普遍存在于人體中，多為IgG 。HA可與試劑中抗體的Fc或者F(ab)區(qū)域的決定簇結(jié)合，從而干擾免疫反應(yīng)。,人抗動物抗體（HAAA）,與HA具有一定的同源性，均能發(fā)生交叉反應(yīng)，造成干擾免疫途徑較為明確，動物免疫球蛋白治療或接觸史具有高親和力，可定向結(jié)合到動

9、物的抗原表位上HAAA有IgA，IgG，IgM等多種類型，又可分為抗同種型，抗獨特型，抗抗獨特型等三類物種廣泛，目前已報道抗鼠，牛，山羊，綿羊，馬等多種抗體不同種動物Ig分子間蛋白質(zhì)序列有大量同源性，因此抗動物抗體可與多種動物免疫球蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)接觸動物蛋白兩周后可產(chǎn)生抗體，存在時間可長達(dá)30個月,人抗鼠抗體（HAMA）,由于鼠抗在單克隆抗體影像，抗體治療以及診斷試劑中的廣泛應(yīng)用，使得HAMA尤其受關(guān)注抗同種型，抗獨

10、特型，抗抗獨特型,HAMA干擾機(jī)制,HAMA干擾機(jī)制,HAMA的鑒別,稀釋樣本測定的值不成比例用參考試劑盒測定進(jìn)行對比其他試劑盒驗證加入清潔抗體進(jìn)行對比HAMA測定試劑盒（6 HAMA試劑盒） 包被鼠抗，標(biāo)記鼠抗的夾心法 包被鼠抗，標(biāo)記抗人IgG/IgM的間接法,內(nèi)源性抗體干擾的消除,試劑盒的設(shè)計 原材料的選擇 去除Fc片段 嵌合抗體（Roche TSH/CEA） 雞抗體

11、樣本的預(yù)先處理 固相血清吸附 蛋白A之類的固相吸附劑 PEG6000處理樣本 樣本酸和熱聯(lián)合處理加入阻斷劑 清潔抗體,商品化的異嗜性抗體阻斷劑,HBR：單克隆鼠抗人IgMIIR：由異嗜性抗體和人抗動物抗體為免疫原產(chǎn)生的混合的鼠單抗。,簡單了解ROCHE（IEP）,簡單了解ROCHE（IEP）,簡單了解ROCHE（IEP）,自身抗體（Autoanalyte antibodies),嗜靶抗原的自身

12、抗體，與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，可對靶抗原的測定結(jié)果造成干擾。目前已知存在的自身抗體：THAAB、Anti-Tg、IAA，Anti-PRL等干擾舉例：高泌乳素血癥（巨泌乳素） 有生物和免疫活性的 23kD 泌乳素單體；缺乏生物活性約50- 60kD 的大泌乳素；無或不發(fā)揮任何生物活性但有免疫反應(yīng)性 150-170kD 的巨泌乳素。 巨泌乳素： PRL 與其 IgG型抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物,因其分子量大而

13、不能通過毛細(xì)血管壁 ,無法與受體結(jié)合而不能發(fā)揮生物活性 , 在體內(nèi)的半衰期較長 ,在循環(huán)中累積 , 被視作PRL 檢測從而造成 PRL 濃度的假性增高。 樣本用PEG沉淀處理,其他一些干擾因素,副蛋白（paraprotein） 由異常增殖的腫瘤漿細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白。 粘度增加導(dǎo)致樣本量減小/非特異性的結(jié)合分析物或抗體纖維蛋白原 干擾反應(yīng)過程藥物，類似物，代謝物HOOK效應(yīng),總結(jié),監(jiān)管機(jī)構(gòu)