nrf缺陷損害小鼠食管黏膜的屏障功能

1、Nrf2缺陷損害小鼠食管黏膜的屏障功能,冬威敏建,內(nèi)容,驗證Nrf2參與食管黏膜的屏障功能，在抵抗胃食管反流病中發(fā)揮保護作用,目的,人食管樣品獲取、小鼠手術(shù)模型的建立； 測定跨膜電阻； 食管黏膜超微結(jié)構(gòu)變化的鏡檢； 食管黏膜ATP含量測定； 基因芯片、免疫組化、Western雜交和染色質(zhì)免疫共沉 淀評價基因表達(dá),實驗設(shè)計,Nrf2缺陷通過破壞依賴能量的緊密連接而損害食管屏障功能,結(jié)論,,,,,,,,食管黏膜屏障功能,

2、黏膜屏障系統(tǒng)由3部分組成： 上皮前屏障——包括表面黏液層（作用低到可以忽略），不移動水層和上皮細(xì)胞分泌的碳酸氫根離子； 上皮屏障——包括多層磷狀上皮細(xì)胞膜、細(xì)胞間連接復(fù)合物（緊密蛋白、糖蛋白機制和緩沖劑）、細(xì)胞內(nèi)緩沖劑、和膜離子轉(zhuǎn)運蛋白； 上皮后屏障——包括血液流動和酸堿平衡,,,,細(xì)胞質(zhì),1,（Nfe2L2，紅細(xì)胞衍生核因子2樣蛋白2）屬于轉(zhuǎn)錄因子CNC家族，含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（bZip結(jié)構(gòu)），調(diào)

3、節(jié)解毒和抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶的表達(dá)，是一種主要的細(xì)胞防御途徑,Nrf2蛋白,Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1，一種與胞漿肌動蛋白結(jié)合的含624個氨基酸的多肽，是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要調(diào)控因子,細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種蛋白的表達(dá)、細(xì)胞分化和凋亡，同樣含有bZip結(jié)構(gòu)的。大Maf蛋白可以直接活化相應(yīng)基因，小Maf蛋白必須與其他具有轉(zhuǎn)錄活性的bZip蛋白結(jié)合，形成異源二聚體促進基因轉(zhuǎn)錄，或自身形成同源二聚體抑制基因轉(zhuǎn)錄,Kea

4、p1蛋白,小Maf蛋白,正常生理條件,氧化應(yīng)激或外源物質(zhì)刺激,細(xì)胞核,,ARE,,Nrf2信號通路在小鼠食管黏膜發(fā)育的成熟階段被激活。在這個階段，角質(zhì)化的復(fù)層磷狀上皮持續(xù)變厚，最后形成成人的食管黏膜。由于角質(zhì)化層是主要的抵抗物理應(yīng)激和化學(xué)損傷的保護層，末端分化角質(zhì)化細(xì)胞表達(dá)能夠通過淬滅活性氧來提供保護作用的蛋白，故推測Nrf2可能參與食管黏膜屏障功能，可能在胃食管反流病中發(fā)揮保護作用。,實驗設(shè)計,人類食管活檢樣品 采樣人排除條件；

5、10副正常人和非糜爛性胃食管反流病患者的活檢組織樣品；在胃鏡檢查期間從（食管）5cm近端到胃食管連接處獲得的。動物手術(shù)模型的建立 8周齡的野生型和Nrf2缺陷型C57BL/6J小鼠，每組5只。麻醉之后通過上中線切口進行吻合手術(shù)。食管胃吻合手術(shù)的目的是消除括約肌功能，允許自由的胃液反流，建立胃反流模型；食管胃十二指腸吻合術(shù)加胃切除術(shù)是為了獲得十二指腸反流模型；食管胃十二指腸吻合術(shù)是為了獲得混合反流模型。吻合手術(shù)之后，清洗腹腔，

6、用6-0絲線縫合腹腔。,十二指腸,,食管胃吻合術(shù)：在食管遠(yuǎn)端和前胃處作3個越5mm切口，然后精確地黏膜對黏膜縱向縫合。,食管胃十二指腸吻合術(shù)：在食管和十二指腸上作2個5mm切口，然后精確的黏膜對黏膜縫合。,食管胃十二指腸吻合術(shù)加胃切除術(shù)：除了食管胃十二指腸吻合術(shù)，在胃食管連接處和幽門處結(jié)扎后切除胃部。,實驗設(shè)計,測跨膜電阻：食管黏膜組織浸入冰冷富氧的林格氏溶液，立即在迷你尤斯灌流室將黏膜一側(cè)朝上固定住。平衡30min后，在2h內(nèi)每15m

7、in，獲取一次PD（電勢差）、Isc(短路電流)和RT（總電阻）的基礎(chǔ)電子讀數(shù)。食管黏膜超微結(jié)構(gòu)變化的鏡檢：每組處死上3只鼠，切開食管黏膜組織，用二甲胂酸緩沖液固定，之后用醋酸鈾酰染色，以聚/床812樹脂包裹，超薄切片機切厚薄兩種切片，厚切片用甲苯胺藍(lán)硼砂染色后，光鏡下為薄切片尋找適合鏡檢區(qū)域，薄切片固定在銅柵格上，用醋酸鈾酰和雷諾檸檬酸鉛進行雙染，透射電子顯微鏡鏡檢。用顯微生物學(xué)組件分析鏡檢照片上至少30個細(xì)胞的細(xì)胞間隙和電子致密

8、物質(zhì)密度。 細(xì)胞間隙是測定兩個相鄰細(xì)胞細(xì)胞膜之間的區(qū)域。細(xì)胞間隙中的電子致密物質(zhì)密度用除以細(xì)胞間隙得到的平均灰度值計算。用方差分析比較各組之間的差異。,實驗設(shè)計,RNA分離：每組處死3只鼠，切開食管黏膜，用RNA組織提取試劑盒提取總RNA，凝膠電泳測質(zhì)量，分光光度計測濃度，生物分析儀測RNA完整性（RIN）。（RIN是RNA降解程度的指標(biāo)，RNA的RIN必須在7以上才適合做芯片分析）基因表達(dá)譜分析：文中的芯片分析就是基因表達(dá)譜

9、分析，目的是分析對照組和模型組食管黏膜組織中各種差異表達(dá)的基因和基因簇及其豐度。（基因表達(dá)譜是通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫，大規(guī)模cDNA測序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群體組成，從而描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息。一般需要純化mRNA做表達(dá)譜分析，本文沒有說明有沒有提純mRNA)使用安捷倫雙通道小鼠4×44微陣列芯片，通過北卡羅萊納大學(xué)的芯片數(shù)據(jù)庫

10、進行數(shù)據(jù)預(yù)處理以進行質(zhì)量過濾和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。獲取的芯片數(shù)據(jù)映射的基因標(biāo)記作為基因表達(dá)值。使用Excel進行組間（正常組和模型組）基因芯片顯著性分析獲取差異表達(dá)基因（假陽性平均數(shù)小于1）?；虼胤治觯ɑ蚣细患确治觯┮彩怯肊xcel進行的。,實驗設(shè)計,Western雜交：目的獲得緊密連接蛋白4，緊密連接蛋白1，環(huán)氧化酶4和Nrf2在黏膜組織中的表達(dá)情況。 處死小鼠切開食管黏膜；從食管黏膜、舌組織和肝臟組織中分離總蛋白；BCA蛋白試

11、劑測蛋白濃度；蛋白樣品通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；轉(zhuǎn)移到PVDF聚偏二氟乙烯膜中；用脫脂乳粉封閉后，以兔子的抗緊密連接蛋白-1（Cldn1）的多克隆抗體，兔子的抗緊密連接蛋白-4(Cldn4)的多克隆抗體、小鼠的抗環(huán)氧化酶-4(Cox-4)的單克隆抗體或者兔子的抗Nrf2多克隆抗體（都經(jīng)特定緩沖液稀釋過）作為探針在4℃反應(yīng)過夜；將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠或者兔子的第二抗體共培養(yǎng)；通過辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光底物利用X光顯影。為了驗證

12、等量上樣（黏膜組織），將印記剝離并使用小鼠的抗β-肌動蛋白(β-Actin)的單克隆抗體進行重新雜交。（β-肌動蛋白是在細(xì)胞的表達(dá)水平通常不會發(fā)生改變，被廣泛用于Western時上樣量是否一致的內(nèi)參，通過內(nèi)參證明你要檢測的蛋白表達(dá)水平的變化）,實驗設(shè)計,組織化學(xué)染色：黏膜組織按常規(guī)方法制作石蠟切片，按標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)行HE染色，之后用顯微生物學(xué)組件檢測切片獲得角質(zhì)化層厚度。（細(xì)胞核紫藍(lán)色，胞漿及胞外基質(zhì)為紅色）免疫組織化學(xué)染色：目的是定位差

13、異表達(dá)的Nrf2、8-OHdG、Cldn4和Cldn1等蛋白在組織中的表達(dá)位置。室溫下將脫蠟切片浸泡在包含0.3%過氧化氫的甲醇中15min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，之后進行抗原修復(fù)。以兔子的抗-Nrf2多克隆抗體，兔子的抗血紅素加氧酶-1(HO1)多克隆抗體，兔子的抗緊密連接蛋白-1(Cldn1)多克隆抗體，小鼠的抗緊密連接蛋白-4(Cldn4)單克隆抗體或者小鼠抗8-羥基脫氧鳥苷單克隆抗體(8-OHdG)做為1抗在4℃反應(yīng)過夜。

14、以抗角蛋白5（Keratin5）抗體作為免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)對照（陽性對照），之后用PBS沖洗組織切片，并與過氧化氫酶標(biāo)記的第二抗體在37℃共培養(yǎng)30分鐘。使用抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶反應(yīng)試劑盒以二氨基聯(lián)苯胺作為發(fā)色物檢測抗體復(fù)合物。（染色結(jié)果陰性藍(lán)色、陽性細(xì)胞質(zhì)橘紅色，陽性細(xì)胞核深橘紅色）計算并分析10個正常人和胃食管反流病人的樣品，及Nrf2缺陷型C57BL小鼠、胃部、十二指腸和混合反流模型小鼠的3個樣品的Nrf2陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百

15、分比與核染色細(xì)胞占總陽性細(xì)胞的百分比。陽性染色細(xì)胞的百分比通過3只野生型小鼠和3只Nrf2缺陷型小鼠測定。進行統(tǒng)計分析以比較野生型和Nrf2缺陷型小鼠的8-羥基脫氧鳥苷的表達(dá)水平。,實驗設(shè)計,ATP含量測定：食管黏膜組織樣品稱重，并在三氯乙酸中均質(zhì)。用蒸餾水稀釋上清液，用一種生物熒光ATP試劑盒測定ATP。使用微孔板檢測儀（即酶標(biāo)儀）的ATP熒光模式測定3min內(nèi)的熒光信號，設(shè)定積分時間為1.0s，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用測得總量除以每個樣品的

16、各自的重量得到ATP的濃度。染色質(zhì)免疫共沉淀:目的是確定推測的Cldn4、Cldn1是不是Nrf2的靶基因。通過錨定組合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（TFBS）聚類分析預(yù)測緊密連接蛋白4的5kb長的5’-上游DNA序列中的Nrf2結(jié)合位點。在緊密連接蛋白4的上游?341bp ~ ?347bp 和?423bp ~ ?429bp片段處找到了“保守結(jié)合位點簇組合”（TGAGTCA）。使用EZ-ChIP試劑盒對三個平行樣進行染色質(zhì)免疫沉淀分析。使用對

17、照組小鼠免疫球蛋白G（IgG）或者兔子的抗Nrf2多克隆抗體進行免疫沉淀操作。取2μL免疫沉淀的DNA用下面的引物對進行35個循環(huán)的PCR擴增：緊密連接蛋白4 (5′-GTTGTCCCCACCCGGTGAGCATC-3′和5′-GGCCAACAAAGGCGTTCAGAGGC-3′; 預(yù)測大小: 168 bp); 醌氧化還原酶1 （Nqo1） (5′-GCAGTTTCTAAGAGCAGAACG-3′ 和5′-GTAGATTAGTCCTCA

18、CTCAGCCG-3′; 預(yù)測大小: 176 bp); P63（一種腫瘤抑制基因） (5′-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3′和5′GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3′; 預(yù)測大小: 210 bp)。作為一種知名的Nrf2靶基因，醌氧化還原酶1作為陽性對照，P63（不是Nrf2靶基因）作為陰性對照。,結(jié)果與討論,正常人,胃食管反流病人,圖1：人體活檢樣品的組織化學(xué)免疫染色,Nrf2在正常人食管活檢組織中的表達(dá)（A、

19、C、E）；Nrf2在胃食管反流病人活檢組織中的表達(dá)（B、D、F）；C、E為A的局部放大圖，D、F為B的局部放大圖。（染色結(jié)果陰性藍(lán)色、陽性細(xì)胞質(zhì)橘紅色，陽性細(xì)胞核深橘紅色）在正常人食管中，Nrf2蛋白主要存在于上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（C），而不是存在于基底細(xì)胞中（E）。但在胃食管反流病人的活檢樣品中（B），Nrf2在上皮細(xì)胞（D）和基底細(xì)胞（F）中過量表達(dá)，并易位到細(xì)胞核中。,結(jié)果與討論,正常小鼠食管黏膜中Nrf2蛋白出現(xiàn)在上皮細(xì)胞和基

20、底旁細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，胃反流、十二指腸反流或混合反流4周后，在上皮細(xì)胞，基底旁細(xì)胞和基底細(xì)胞的細(xì)胞核中出現(xiàn)了Nrf2蛋白，上調(diào)顯著；十二指腸反流和混合反流模型中，血紅素加氧酶表達(dá)上調(diào)（Nrf2的一種標(biāo)記物）。,圖2：四周后小鼠模型樣品中Nrf2的組織化學(xué)免疫染色結(jié)果,非手術(shù)對照,十二指腸反流,胃反流,混合反流,人類活檢樣品：胃食管反流樣品中Nrf2蛋白表達(dá)上調(diào)顯著，在細(xì)胞核中表達(dá)上調(diào)顯著；血紅素加氧酶(Nrf2靶基因)表達(dá)上調(diào)顯著,小鼠

21、模型樣品：反流模型樣品4周后，食管黏膜組織中Nrf2表達(dá)上調(diào)顯著；十二指腸、混合反流模型中血紅素加氧酶表達(dá)上調(diào),Nrf2在胃食管反流病中被激活,結(jié)果與討論,非手術(shù)對照,胃灌流,十二指腸灌流,混合灌流,圖3：野生型和Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜跨膜電阻，兩表縱坐標(biāo)為電阻，上表橫坐標(biāo)為時間,跨膜電阻是黏膜屏障功能的指標(biāo)。Nrf2缺陷組的食管黏膜跨膜電阻在每個時間點顯著低于野生型小鼠，表明Nrf2在食管黏膜中發(fā)揮了抵抗離子轉(zhuǎn)運的保護作用。

22、反流手術(shù)4周后，野生型和Nrf2缺陷型小鼠都出現(xiàn)了食管跨膜電阻的顯著降低，尤其是在那些經(jīng)歷胃反流和十二指腸反流的小鼠中。胃反流和混合反流組中，Nrf2缺陷進一步降低了食管的跨膜電阻，但十二指腸反流組卻沒因Nrf2進一步降低跨膜電阻。這些數(shù)據(jù)揭示了在是否患胃食管反流病時，Nrf2都在食管抗性方面發(fā)揮保護作用。,,,,Nrf2缺陷型,混合反流模型,,圖4：透射電子顯微鏡下反流四周后小鼠食管黏膜基底細(xì)胞層中的超微結(jié)構(gòu)變化的形態(tài)學(xué)和量化

23、（放大倍數(shù)4,400x; 尺寸欄size bar = 2 μm）,非手術(shù)對照組,胃反流模型,野生型,結(jié)果與討論,十二指腸反流模型,胃反流Nrf2缺陷組食管基底層中細(xì)胞間隙的增寬、線粒體數(shù)量的減少、可見細(xì)胞橋粒減少、基底細(xì)胞之間的電子致密物質(zhì)減少，表明Nrf2缺陷型小鼠的基底細(xì)胞之間的細(xì)胞間粘附力降低了；胃反流Nrf2缺陷型小鼠中從基底細(xì)胞延伸進入基底膜的細(xì)胞過程也減少了，表明Nrf2缺陷型小鼠中，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附力也降低了；

24、胃、十二指腸、混合反流的野生型小鼠，黏膜基底層細(xì)胞間隙增寬；胃、十二指腸、混合反流的Nrf2缺陷小鼠顯示，Nrf2缺陷顯著加劇了黏膜超微結(jié)構(gòu)變化；定量分析表明Nrf2缺陷鼠的細(xì)胞間隙顯著增寬，電子致密物質(zhì)顯著減少，在胃反流模型中更加顯著。,結(jié)果與討論,食管黏膜組織化學(xué)染色（HE染色）結(jié)果：野生型和Nrf2缺陷型小鼠的食管黏膜沒有組織形態(tài)和厚度的明顯差異。,結(jié)果與討論,野生型和Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜基因及基因簇表達(dá)的差異基因表達(dá)譜

25、（芯片分析）結(jié)果基因表達(dá)差異：相比于野生型小鼠，15種已知的Nrf2靶基因（醛糖還原酶8 Akr1b8, 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基Gclc, 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A3Gsta3, 谷胱苷肽s轉(zhuǎn)移酶m1 Gstm1, Gstm3, 紅細(xì)胞衍生核因子2樣蛋白2 Nfe2l2, 醌氧化還原酶1 Nqo1, 胎球蛋白A Ahsg, Ces1, Esd,Gstp1, Mgst1, Npn3, Pparg and Selenbp2）在Nrf2缺

26、陷型小鼠中的表達(dá)被下調(diào)了。由于這些基因都是已知的與應(yīng)激反應(yīng)和解毒作用相關(guān)基因，數(shù)據(jù)表明Nrf2在野生型小鼠的食管黏膜細(xì)胞中正?；罨蕴峁┑挚股響?yīng)激的保護作用。（在胃反流模型中，相比于野生型，Nrf2缺陷型小鼠中有7種已知的Nrf2靶基因（Nqo1, Gstm1, Akr1b8, Gstm3,Gclc, Pln, Gstp1）表達(dá)被下調(diào)了。在十二指腸反流模型中，5中已知的Nrf2靶基因表達(dá)被下調(diào)了（Nfe2l2, Nqo1, Gstm

27、1, Gstm3,Ptgr1）。在混合反流模型中，有24種已知的Nrf2靶基因的表達(dá)被下調(diào)了（Gstm1, Gsta3, Gstm3, Nfe2l2, Nqo1, Gstm2, Blvrb, Hmox1, Entpd5, Cbr3, Ppp1r12b,Gclc, Mgst3, Gstm5, Txnrd1, Cat, Meis1, Ftl1, Sdpr, Selenbp2, Pparg, Gstp1, Esd, Mgst1)。）基因簇

28、表達(dá)差異：相比于野生型小鼠，Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜中有20個跟刺激/應(yīng)激有反應(yīng)和氧化還原酶活性相關(guān)的基因簇的表達(dá)被下調(diào)了；與Nrf2缺陷型小鼠基底細(xì)胞中線粒體數(shù)量降低相一致，在缺陷信小鼠的食管黏膜中有11個與線粒體合成相關(guān)的基因簇和32個與代謝和能量相關(guān)的基因簇表達(dá)被下調(diào)了,結(jié)果與討論,圖5：野生型和Nrf2缺陷型小鼠黏膜中8-OHdG的組織化學(xué)免疫染色結(jié)果（A、B），ATP濃度（C）和線粒體標(biāo)記蛋白COX-4的Western雜交結(jié)

29、果（D）,8羥基脫氧鳥苷是一種DNA氧化損傷的標(biāo)記物。相比于野生型，8OHdG在Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)急劇升高（A，B，A'，B'）；相比于野生型，缺陷型小鼠食管黏膜中ATP含量顯著降低（C）；環(huán)氧酶4是一種線粒體標(biāo)記蛋白，在缺陷型小鼠中，Western雜交測定的Cox IV表達(dá)顯著下調(diào)（D）。這些結(jié)果表明Nrf2缺陷型小鼠的食管黏膜出現(xiàn)了線粒體功能障礙。,,,,Nrf2缺陷型,結(jié)果與討論,

30、野生型,圖6：野生型與Nrf2缺陷型小鼠黏膜中Cldn4、Cldn1組織化學(xué)免疫染色結(jié)果（A、B、C、D）、Cld4與Cld1的Western雜交結(jié)果（E）及Cldn4的染色質(zhì)免疫共沉淀分析結(jié)果,緊密連接是食管組織中最重要的屏障，緊密連接蛋白是構(gòu)成緊密連接的一類關(guān)鍵蛋白，Cldn家族中，Cldn4和1在食管黏膜中占主導(dǎo)地位。組化免疫染色表明Cldn4在野生型小鼠的食管黏膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中表達(dá)了（A），在Nrf2缺陷型小鼠中的表達(dá)則

31、下調(diào)（C）。在缺陷型小鼠中，Cldn1的表達(dá)沒有明顯改變(B、D)（基因譜分析表明Cldn1DNA上游序列缺乏Nrf2結(jié)合位點，可以解釋這個現(xiàn)象）；Western雜交表明相比于野生型，缺陷型的食管黏膜中Cldn4的表達(dá)下調(diào)了33%。染色質(zhì)免疫沉淀表明非手術(shù)對照模型和十二指腸反流模型食管黏膜中Nrf2在Cldn4的AREs（F）上直接結(jié)合。染色質(zhì)免疫沉淀分析還檢測到了在Nrf2靶基因的一個陽性對照中出現(xiàn)了Nrf2直接結(jié)合到醌氧化還原酶

32、1上的現(xiàn)象。,,,,這些結(jié)果說明Cldn4是Nrf2的靶基因，Nrf2缺陷會導(dǎo)致緊密連接的破壞，進而損害屏障功能,Nrf2在食管黏膜中發(fā)揮了抵抗離子轉(zhuǎn)運的保護作用,胃食管反流病導(dǎo)致黏膜超微結(jié)構(gòu)改變，Nrf2缺陷會加劇變化,Nrf2缺乏抑制與代謝及能量合成相關(guān)的基因的表達(dá),Nrf2缺乏導(dǎo)致線粒體功能障礙,在正常生理條件下或氧化應(yīng)激刺激時，食管黏膜中的Nrf2都會活化以提供抵抗應(yīng)激的保護作用。 Cldn4是Nrf2的靶基因，Nrf