基因表達(dá)沉默技術(shù)

1、1,藥學(xué)系藥物基因組學(xué)教研室2010.06.18,基因表達(dá)沉默技術(shù),2,教學(xué)內(nèi)容及要求,,1,,2,,3,,4,反義核酸技術(shù),核酶技術(shù),基因敲除技術(shù),RNA干擾 技術(shù),重點(diǎn),熟悉,3,參考資料,《基因工程及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)-基因工程分冊》，北京大學(xué)出版社，靜國忠編 自備材料（個人實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)）,4,第一節(jié) RNA干擾技術(shù),5,掌握,RNA 干擾 (RNA interference, RNAi):由小雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA

2、高效特異性降解的現(xiàn)象。小干擾RNA: 具有干擾功能的這種短雙鏈RNA就稱為小干擾RNA（Small interfering RNA,siRNA)。,6,注射,,sense,秀麗線蟲,antisense,1995年． ． ． ． ． ．,7,反義RNA(antisense RNA)對基因抑制效應(yīng)比較微弱；而雙鏈RNA（dsRNA）能夠高效特異性阻斷靶基因的表達(dá)。,an important finding！,． ． ． ． ． ． 1

3、998年,8,Craig C. Mello克雷格·梅洛,Andrew Z. Fire安德魯·菲爾,2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine,9,隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAi也存在于水稻、煙草、果蠅、小鼠及人等幾乎所有的真核生物中。,10,靶,siRNA在ATP參與下形成RISC復(fù)合體，被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中的反義鏈指導(dǎo)移至靶mRNA，靶mRNA被切割后誘發(fā)宿主細(xì)胞針

4、對這些mRNA的降解反應(yīng)。,外源長dsRNA在ATP作用下被RNaseⅢ Dicer切割成21nt左右、由正義和反義鏈組成的siRNA,重點(diǎn),11,siRNA,21 nt,難點(diǎn),12,1）靶序列的調(diào)出,http://www.ncbi.nlm.nih.gov,National Center forBiotechnology Information,13,14,15,2）利用免費(fèi)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行siRNA設(shè)計(jì),InvitrogenTaka

5、raOligoegine,16,軟件的選擇原則,1、選擇可讀框內(nèi)、翻譯起始位點(diǎn)之后50～100nt的序列作為靶序列；2、選擇的靶位5’端之前的兩個堿基為AA；3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；4、堿基數(shù)目控制在19～21nt；5、避免連續(xù)3個或3個以上的相同堿基；6、避免重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)以免形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)；7、靶序列同數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對。,17,我用的軟件：siDirect,18,3）siR

6、NA合成或表達(dá),RNA聚合酶Ⅲ啟動子（包括U6或H1）：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)明確；轉(zhuǎn)錄生成小RNA；轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無polyA尾；轉(zhuǎn)錄終止為5個連續(xù)的U。,19,20,21,22,3 mg/ml 正向引物 1 μl3 mg/ml 反向引物 1 μl,90°C 4 min,70°C 10 min,室溫,,訂購合成的引物序列退火,23,4) siRNA working?,24,mRNA:Real-time PCR

7、 Protein: Western blot,17siRNA Mock,25,5)合成or構(gòu)建載體？,化學(xué)合成siRNA： 瞬時轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)花費(fèi)高 使用的時候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）處理過的滅菌蒸餾水溶解，這是因?yàn)閟iRNA易被RNA酶降解。B.載體：為了長期觀察基因沉默后的影響，需要長期表達(dá)siRNA。C. 載體選擇：易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用質(zhì)粒載體，難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用逆轉(zhuǎn)錄載體或慢病毒載體。,26,6）體外導(dǎo)入

8、細(xì)胞,a.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：,,,,,,,,,,具體操作步驟：按照脂質(zhì)體說明書進(jìn)行,27,b.電穿孔導(dǎo)入：,,,28,c.病毒感染（以腺病毒為例）：,,29,next,30,,第二節(jié) 反義核酸技術(shù),31,1978年，Stephenson 和Zamecnik首次報道了反義寡脫氧核苷酸可抑制勞斯肉瘤病毒RSV的復(fù)制現(xiàn)象。1984 年，Izant weintraub提出了“反義核酸技術(shù)”的概念。,Inhibition of Rous sarco

9、ma viralRNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA , 1978 ;75 : 285 - 288.,32,,反義寡核苷酸概念：正義鏈互補(bǔ)的一段核苷酸序列，包括反義DNA和反義RNA。,,反義RNA技術(shù),反義DNA技術(shù),33,直接作用于靶mRNA的SD序列或部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從

10、而易被RNA酶H降解。,,,,,,,反義核酸,,mRNA,,RNase H,34,論著超過１６０００篇?；蚬δ苎芯浚?1994年流行） 如抗病毒或抗腫瘤基因治療研究等領(lǐng)域。,35,1998年8月27日，美國食品藥品管理局（FDA）正式批準(zhǔn)了由ISIS公司開發(fā)的全球第一個反義藥物“Vitravene” （福米韋生，fomivirsen）在美國上市。該藥抗病毒作用較強(qiáng)，是更昔洛韋的1000倍，用于治療巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎和

11、艾滋病人并發(fā)巨細(xì)胞視網(wǎng)膜炎,有效率高達(dá)80%-90%。Vitravene為注射劑，患者每月只需注射一次藥物（利用專用針頭直接注射進(jìn)眼球內(nèi)），不良反應(yīng)有虹膜炎、玻璃體炎，發(fā)生率為25％，用糖皮質(zhì)激素治療可緩解或消除其炎性反應(yīng)。,,,2１個硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸組成５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇,36,a.避免內(nèi)源性核酸酶對其降解b.提高自身穩(wěn)定性以及與靶分子的親和力,H,deoxyribose,提高有效性,

12、技術(shù)難點(diǎn),修飾,37,第一代硫代修飾（Phosphorothioate）,,Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathways,O,,38,第二代修飾(2’-O-methyl,2’-O-methoxyethyl),,,,Resisting To Nucleases；not activating RNase H pathways,39,2001 主要用于治療老年人中十分常見的視網(wǎng)膜黃斑退

13、化癥,Macugen 哌加他尼,40,2003 新一代抗HIV新藥，屬于病毒的融合阻止劑類藥物,Fuzeon,20570$,41,Tysabri,2004 專治多發(fā)性硬化癥,42,next,43,第三節(jié) 核酶技術(shù),44,核酶（ribozyme） ribonucleic acid enzyme 具有催化活性的RNA，化學(xué)本質(zhì)是RNA,卻具有酶的催化功能。,45,,切赫(T.R.Cech)（1947-），美國人, 他獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)發(fā)

14、現(xiàn)四膜蟲轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物rRNA前體，可切除自身的413個核苷酸的內(nèi)含子，使兩個外顯子拼接起來，變成成熟的rRNA分子。,Thomas R.Cech,1982,46,S.Altman研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌RNaseP的蛋白質(zhì)部分除去后，留下RNA能夠切割rRNA前體的5’端。,1983,47,1989 Nobel Prize in Chemistry,核酶的發(fā)現(xiàn)改變了“所有酶都是蛋白質(zhì)”的傳統(tǒng)觀念,48,,有封閉切割RNA,（1994年左右比

15、較流行的研究工具）,49,,通常由60個核苷酸左右組成；底物部分：含有GU序列；保守序列：13個堿基。,錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)示意圖,50,next,51,第四節(jié) 基因敲除技術(shù),時間：80年代末功能：建立基因失活或缺失的動物模型,52,a. 胚胎干細(xì)胞（ embryonic stem cell，ES）分離培養(yǎng),取自小鼠受精卵發(fā)育第4，5天的胚胎細(xì)胞 能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性,1981年，馬丁·埃文斯(Martin J．

16、Evans) 從正常的小鼠囊胚中分離到了ES細(xì)胞。小鼠ES細(xì)胞的分離和應(yīng)用是ES細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的里程碑。,,53,同源重組：是指發(fā)生在減數(shù)分裂或者有絲分裂過程中相同或者相似DNA序列間的重組，通常通過一對同源分子非姊妹染色體間的斷裂而產(chǎn)生新的重組片段。,b. 同源重組技術(shù)應(yīng)用,54,1985年，奧利弗·史密塞斯(Oliver Smithies) 等首次報道在腫瘤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了人工打靶載體和內(nèi)源β-球蛋白基因間的同源重組。,55,1

17、988年，卡佩基安德等發(fā)展了一種稱為“正負(fù)篩選”的策略，將胸腺嘧啶激酶基因（tk）置于打靶載體的外側(cè)，作為篩選的負(fù)性標(biāo)記。這比單用陽性篩選正確克隆富集的倍數(shù)高3~10倍，真正使得同源重組技術(shù)得以應(yīng)用。,馬里奧·卡佩基安德(Mario R．Capechiand),丙氧鳥苷,56,Martin Evans馬丁·埃文斯,Mario Capecchi馬里奧·卡佩基,Oliver Smithies奧利弗