魏氏梭菌及其主要毒素的研究進展

1、魏氏梭菌及其主要毒素的研究進展,報告內(nèi)容,魏氏梭菌概述魏氏梭菌毒素研究,,綜述,分型及其依據(jù),,魏氏梭菌產(chǎn)生的毒素,四種主要毒素研究進展,純化及鑒定,細菌毒力,綜述,革蘭氏陽性有莢膜不運動的厭氧大桿菌，芽孢橢圓形,位于菌體中央或次極端，芽胞直徑不大于菌體，在一般培養(yǎng)時不易形成芽胞，在無糖培養(yǎng)基中有利于形成芽胞（菌體形態(tài)）廣泛分布于自然界，同時也是腸道中的常見菌之一，在一定條件下，可引起各種嚴重疾病發(fā)病急、死亡快，因

2、此對于本病的防制主要用疫苗進行免疫預(yù)防危害：猝死癥，家禽壞死性腸炎，人食物中毒及氣性壞疽 ；家畜腸毒血癥、壞死性腸炎，痢疾,培養(yǎng)特性,本菌雖屬厭氧性細菌，但對厭氧程度的要求并不太嚴，2%~10%的CO2條件下，生長更好在普通培養(yǎng)基上能生長，若加葡萄糖，血液，則生長更好生長適宜溫度為37-47℃，多認為43-47℃為最宜溫度，在適宜條件下增代時間僅8min,,培養(yǎng)特性,血平板：雙層溶血環(huán) 內(nèi)環(huán)完全溶血-θ毒素

3、 外環(huán)不完全溶血- α毒素蛋黃瓊脂平板：Nagler反應(yīng)庖肉培養(yǎng)基：數(shù)小時即可見到生長，產(chǎn)生大量氣體，肉渣或肉塊變?yōu)槁詭Х凵?，但不被消?牛乳培養(yǎng)基：“洶涌發(fā)酵”（stormy fermentation）,分型及其依據(jù),根據(jù)此菌產(chǎn)生外毒素的種類，可將其分為A、B、C、D和E 5個型 A型菌：αB型菌：αβε C型菌：αβD型菌：αεE型：αι,魏氏梭菌與相應(yīng)疾病,其中，A型菌主要引起人的氣性壞疽和食物中

4、毒，也可引起動物的氣性壞疽，牛、綿羊、家兔腸毒血癥B型菌主要引起羔羊痢疾；C型菌主要是牛、豬腸毒血癥、羊猝狙D型菌引起羔羊、綿羊、山羊、牛以及灰鼠的腸毒血癥；E型菌可致犢牛、羔羊腸毒血癥，但很少發(fā)生。,分離診斷,,純化,,液體培養(yǎng)基,,65-70°C半小時,,,43°溫箱培養(yǎng),,,3-4小時,,連續(xù)傳代,,,,,鏡檢,TSC.石蕊牛奶,血平板,侵襲力：病原菌有突破宿主皮膚、黏膜 生理屏障等 免

5、疫防御機制，進 入體內(nèi)定居、繁殖和擴散的能 力，包括莢膜、粘附素和侵襲 性物質(zhì)。 毒素：含有損害宿主組織、器官并引起生理功能紊亂的大分子成分。,毒力,,細菌的毒力,莢膜、微莢膜。,黏附素：細菌表面的蛋白質(zhì)。　　　　　　 菌毛分泌物　　　　　　 細菌的表面組分：如磷壁酸。,2、侵襲性物質(zhì)：協(xié)助病菌抗吞噬或向四周擴散。如致病性葡萄球菌凝固酶、A群鏈球菌透明質(zhì)酸酶、鏈激酶等從而有利于細菌

6、在組織中擴散。,㈠侵襲力,1、菌體的表面結(jié)構(gòu),細菌在生長繁殖中產(chǎn)生和釋放的毒性成分，可直接或間接損傷宿主細胞、組織和器官，干擾其生理功能。外毒素內(nèi)毒素,（二）毒素,內(nèi)毒素毒性作用,(A)熱源性,(C)內(nèi)毒素血癥和休克,(D)彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）,(B)白細胞數(shù)目改變,,疫苗現(xiàn)狀,梭菌類的疫苗有單價苗和多聯(lián)苗，單價疫苗在實際應(yīng)用中難以取得很好的效果，原因是致病的梭菌種類較多，而且有的是混合感染，單價苗往往是顧此失彼，不能有效地預(yù)

7、防疾病。國外相繼出現(xiàn)了包括產(chǎn)氣莢膜梭菌的四聯(lián)、五聯(lián)、七聯(lián)和八聯(lián)苗梭菌苗，不僅把梭菌苗聯(lián)合起來，而且還把所梭菌苗與需氧菌苗(如巴氏桿菌苗、沙門氏桿菌苗)聯(lián)合起來，甚至與病毒苗(如羊痘疫苗)聯(lián)合起來進行防疫。,疫苗現(xiàn)狀,國內(nèi)首先出現(xiàn)的是羔羊痢疾，腸毒血癥等單價苗，繼之出現(xiàn)了羊猝狙、快疫二聯(lián)苗，羊黑疫、快疫二聯(lián)苗，快疫、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)苗。文希喆等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、碎狙、腸毒血癥、黑疫五聯(lián)苗。紀金春等(1978)研

8、制成功了快疫、羔羊痢疾、猝狙、腸毒血癥、黑疫和肉毒中毒六聯(lián)苗。,疫苗現(xiàn)狀,上世紀70年代到80年代，中監(jiān)所的文希喆、王泰健、屠偉英等科研人員，在國際上率先開創(chuàng)了梭菌多聯(lián)干粉苗的研究，取得滿意效果，保存期長，使用方便，可以隨意搭配，疫苗的保護期也得到的延長，基本克服了液體苗的缺陷。效力檢驗：多聯(lián)苗所含的成份越多，需要的動物也越多，以致于達到不便檢驗的程度，嚴重阻礙了多聯(lián)苗的發(fā)展，采用免疫動物測定血清中和效價的方法，來評價梭菌苗的效力。

9、其方法是用梭菌苗免疫動物兩次后，用國際單位(I.U.)衡量血清的中和效價，檢驗每批疫苗所需試驗動物為8-12只。,免疫效果與制苗菌液中毒素毒力正相關(guān)抗原含量過大會產(chǎn)生嚴重局部反應(yīng)，會導(dǎo)致安全性檢驗不合格,主要毒素,α毒素,各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生α毒素,它是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要的毒素之一,同時又是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒素是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒素。它具有磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)和鞘磷脂酶(Sphin-gom

10、yelinase)兩種酶活性,能水解細胞膜的主要成分膜磷脂,從而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性,理化性質(zhì)和生物學(xué)特性,α毒素是由370個氨基酸組成的單鏈多肽,分子量為43 ku。它是一種依賴于鋅離子的多功能性金屬酶,具有細胞毒性、溶血活性、致死性、皮膚壞死性、血小板聚集和增加血管滲透性等特性當(dāng)把α毒素加熱至60~70℃時,就可以使其失去活性,當(dāng)進一步加熱到100℃時,又可以恢復(fù)部分活性,α毒素基因的克隆與表達,α毒素基因在禽類和哺乳動物中都是

11、保守的毒素的啟動子是最強的啟動子之一,可被大腸桿菌的RNA聚合酶所識別,因而α毒素在自身啟動子下不僅可在產(chǎn)氣莢膜梭菌本身中高效表達,也可在大腸桿菌中得到高效表達免疫α毒素的C端功能區(qū),來預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌所致氣性壞疽的發(fā)生 劉家森等克隆了α毒素基因序列中從第294個堿基到中止密碼子約900 bp的核苷酸序列,并表達出大小約3. 8 ku的重組蛋白。重組蛋白完全涵蓋了α毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端內(nèi)

12、對α毒素起重要作用的Trp1、His11、Asp56、His68等氨基酸殘基;表達的重組蛋白含量占到菌體蛋白總量的30%以上,且表現(xiàn)出良好的反應(yīng)原性,無毒性現(xiàn)象產(chǎn)生。,β毒素,產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素是由產(chǎn)氣莢膜梭菌B型和C型菌株產(chǎn)生的壞死、致死性毒素,可引起人和動物的壞死性腸炎, 。 β毒素對胰酶敏感，37℃作用30min后即完全失活β毒素分為β1、β2毒素,其中β2毒素是近年確認的由C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的一種新的毒素。β2毒素與β1毒素

13、沒有明顯的氨基酸序列的同源性,但具有相似的生物學(xué)活性。而且,抗β2毒素的抗體能識別純化的β2毒素,并能與β1毒素發(fā)生弱反應(yīng),然而,抗β1毒素的抗體只能與β1毒素反應(yīng),卻不能與β2毒素發(fā)生反應(yīng),表明二者的免疫學(xué)相關(guān)性差,但其機制尚不清楚。,β1毒素,β1毒素是一種強毒素,具有細胞毒性、致死性。純化的β1毒素分子量為34 ku左右,等電點(PI)約為5. 6。,β2毒素,1997年Gibert等首先從來自仔豬壞死性腸炎病例的培養(yǎng)上清中分離純

14、化到這種C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(CWC245)毒素β2毒素與家畜的梭菌性胃腸道疾病有關(guān)β2毒素在豬的胃腸道疾病中發(fā)揮了一定作用β2毒素基因存在于質(zhì)粒上研究剛起步,ε毒素,ε毒素是由B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生，能引起家畜的致死性腸毒血癥,又稱肉性腎病ε毒素的編碼基因etx位于質(zhì)粒上,etx基因編碼的蛋白ε毒素前體在分泌初期是無毒性的,通過蛋白酶去除毒素前體N端的13個氨基酸和C端22個氨基酸后成為有活性的成熟肽,成熟肽分子質(zhì)量為32

15、 ku，參與活化的蛋白酶包括產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的λ蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、α胰凝乳蛋白酶。毒素是致死性毒素,給小鼠靜脈注射納克級的ε毒素,在30 min內(nèi)即可引起小鼠死亡,并且其毒力僅次于肉毒素和破傷風(fēng)毒素,ε毒素,這種通過切除N、C末端兩段序列且還有菌體自身蛋白參與的活化過程較為少見。Miyata S等證明,去除C末端氨基酸殘基是活化作用的關(guān)鍵,而且不同的酶切產(chǎn)生的毒素的N、C末端及其活性也不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶

16、活化的毒素毒力最強,而N末端氨基酸殘基去除與否對毒素活性基本沒有影響。惟有C末端的切除位點對毒素活性,包括在神經(jīng)突觸膜上形成七聚體的能力有影響。去除C末端氨基酸殘基后的成熟毒素其毒性是毒素前體的1 000倍。,ε毒素,ε毒素與宿主細胞表面的作用機制還不是很清楚,但是現(xiàn)已證明它可以識別小鼠腦細胞和突觸小體膜上的唾液糖蛋白受體。目前只有兩種細胞系對ε毒素敏感,分別為MDCK和人成平滑肌瘤G402細胞據(jù)推測這與這兩種細胞表面存在有效結(jié)合毒素的

17、受體有關(guān)。,ι毒素,E型魏氏梭菌分泌 組成 ：酶部分(Ia)和結(jié)合部分(Ib) 功能：（1）Ia是一種ADP核糖轉(zhuǎn)移酶;而Ib是一種細胞結(jié)合蛋白 。（2） Ib與細胞膜的受體結(jié)合后，立即進入細胞膜間隙，形成低聚體，繼而與Ia結(jié)合，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生內(nèi)吞作用。（3）Ib激活后能形成離子通道，而Ia則在pH值低于5.6時封閉這一通道。,產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(CPE),產(chǎn)生 ：A型魏氏梭菌在芽孢期產(chǎn)生的，部分C、D型菌也可產(chǎn)生。 影響因素

18、：pH、溫度和碳源 功能（1）小腸上皮細胞的頂部形成一個小孔，從而造成宿主的體液和電解質(zhì)流失。（2）提供緊密連接蛋白通過的入口。,謝謝大家,菌體形態(tài),雙溶血環(huán),Nagler反應(yīng),在蛋黃瓊脂平板上 ,菌落周圍出現(xiàn) 乳白色渾濁圈,是由卵磷脂酶(α毒素 )分解蛋黃中卵磷脂所致,此現(xiàn)象稱Nagler反應(yīng),為本菌的特點。,洶涌發(fā)酵,產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，凝固，胨化幾乎同時發(fā)生。胨化：分解乳糖產(chǎn)酸，使干酪素凝固，產(chǎn)生的蛋白酶可使凝