二氧化硫脅迫下擬南芥防御基因的差異表達(dá)及表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、逆境脅迫嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育和生產(chǎn)力。植物必須在分子、細(xì)胞、生理和生化水平上響應(yīng)環(huán)境脅迫，通過復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使植株做出相應(yīng)的適應(yīng)性調(diào)整，以求在逆境條件下得以生存。二氧化硫（Sulfur dioxide，SO2）是一種常見的全球性大氣污染物。本文以模式植物擬南芥（4周齡）為材料，用濃度30 mg/m3的SO2暴露72h后，對(duì)擬南芥的基因表達(dá)譜、DNA甲基化特征、microRNA(miRNA)表達(dá)模式等進(jìn)行了分析，研究SO2脅迫下擬

2、南芥防御基因的差異表達(dá)及表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，從DNA和轉(zhuǎn)錄水平上揭示植物對(duì)逆境適應(yīng)的分子機(jī)制。
　　根據(jù)ATH1芯片檢測(cè)結(jié)果，對(duì)擬南芥地上組織細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，在全基因組中共檢出脅迫組和對(duì)照組間差異表達(dá)2倍以上的基因494個(gè)(| R|＞2)，其中上調(diào)表達(dá)220個(gè)，下調(diào)表達(dá)274個(gè)，主要涉及細(xì)胞代謝、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、結(jié)構(gòu)分子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^程。SO2脅迫后，抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘

3、肽過氧化物酶(GPX)基因表達(dá)水平和酶活性增加，抗逆相關(guān)的防御基因如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、細(xì)胞色素P450、熱激轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白等轉(zhuǎn)錄水平提高。同時(shí)，參與抗病反應(yīng)的病程相關(guān)蛋白基因、次生代謝相關(guān)基因（苯丙烷類代謝途徑）、細(xì)胞壁形成相關(guān)基因（纖維素合成酶、伸展蛋白及木質(zhì)素合成相關(guān)）等表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)多種環(huán)境脅迫的交叉抗性。對(duì)9個(gè)差異表達(dá)防御基因進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果表明SO2脅迫后這9個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平提高，與芯片結(jié)果一致

4、，證明由基因芯片篩選出的差異表達(dá)基因信息是可靠的。SO2脅迫誘導(dǎo)擬南芥胞內(nèi)超氧陰離子(O-·)和過氧化氫(H2O2)水平升高，生長素、乙烯生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因激活，活性氧和植物激素等多條途徑參與了擬南芥對(duì)SO2的防衛(wèi)應(yīng)答反應(yīng)，從而提高植株對(duì)逆境的適應(yīng)性。
　　利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)分析擬南芥基因組DNA中CCGG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，采用12對(duì)隨機(jī)引物組合，共擴(kuò)增出703條清晰的譜帶，SO2脅迫誘導(dǎo)

5、胞嘧啶甲基化特征改變，甲基化多態(tài)性為37％，未甲基化和半甲基化位點(diǎn)減少，全甲基化位點(diǎn)增多，基因組DNA總甲基化水平增高，從而有利于脅迫條件下植物基因組的穩(wěn)定。利用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序(Bisulfitesequencing，BS)技術(shù)分析SO2脅迫應(yīng)答基因RD29A、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CCD7)、腈水解酶(NIT2)和ACC合成酶(ACS6)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，在正常生長條件下，RD29A和CCD7基因啟動(dòng)子檢測(cè)區(qū)域中未發(fā)現(xiàn)甲

6、基化，NIT2和ACS6基因啟動(dòng)子檢測(cè)區(qū)域中的CG、CHG和CHH（H代表A、C或T）位點(diǎn)存在不同程度的甲基化。SO2脅迫后，RD29A和CCD7基因啟動(dòng)子區(qū)保持無甲基化狀態(tài)不變，而NIT2和ACS6基因啟動(dòng)子區(qū)不同位點(diǎn)甲基化水平升高或降低，總甲基化水平降低。同時(shí)，NIT2和ACS6基因的轉(zhuǎn)錄水平提高，說明SO2脅迫誘發(fā)擬南芥基因胞嘧啶甲基化水平改變，啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的降低可能與防御基因的誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)，DNA甲基化修飾參與了植物的抗逆

7、生理過程。
　　RT-PCR分析結(jié)果表明，SO2脅迫后擬南芥多個(gè)miRNA誘導(dǎo)表達(dá)，miR162a、miR167a、miR167c、miR319c的表達(dá)量增加;miR398a、miR398c的表達(dá)量降低，其靶基因Cu/Zn超氧化物歧化酶（CSD1和CSD2）的轉(zhuǎn)錄水平增加，二者表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)。脅迫誘導(dǎo)miRNA前體上游序列分析后發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域存在大量的脅迫響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件，對(duì)miRNA自身的表達(dá)起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，說明miR

8、NA上游的調(diào)控因子與下游的靶標(biāo)組成了一個(gè)完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，逆境誘導(dǎo)miRNA表達(dá)改變對(duì)其靶基因進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，參與植物的脅迫響應(yīng)與抗逆調(diào)控。
　　研究結(jié)果表明，SO2脅迫激活擬南芥胞內(nèi)活性氧(H2O2)、植物激素（生長素、乙烯）等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)SOD、POD、GP、GST、細(xì)胞色素P450等多個(gè)防御基因表達(dá)水平提高。同時(shí)，熱激轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白、抗病基因等表達(dá)上調(diào)，從轉(zhuǎn)錄水平上顯示了植株對(duì)多種環(huán)境脅迫的抗性增強(qiáng)。擬南芥DNA甲基