山羊痘病毒某些生物學(xué)特性及其主要結(jié)構(gòu)蛋白P32基因的研究.pdf

1、山羊痘是由羊痘病毒屬（Capripoxvirus）山羊痘病毒（Goat poxvirus，GPV）引起的一種高度接觸性傳染病，臨床上以體溫升高，全身皮膚、呼吸道和消化道黏膜出現(xiàn)痘疹為主要特征。本病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類(lèi)重大動(dòng)物傳染病，我國(guó)也將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。2002年10月以來(lái)，貴州省羊群中首次暴發(fā)疑似山羊痘病例，并迅速波及到8個(gè)養(yǎng)羊較為集中的地區(qū)，對(duì)我省養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了巨大的威脅。為了防制本病，本研究對(duì)我省兩株

2、山羊痘病毒分離株進(jìn)行了某些生物學(xué)特性及其主要結(jié)構(gòu)蛋白P32基因進(jìn)行了詳細(xì)研究。
　　將貴州省山羊痘病毒分離株GPV-LD和GPV-QL接種Vero-E6、BHK-21細(xì)胞，3～7d感染細(xì)胞顯現(xiàn)圓縮、聚集成簇等細(xì)胞病變效應(yīng)；以GPV熒光抗體對(duì)感染細(xì)胞飛片染色，在細(xì)胞漿中檢測(cè)到特異性的黃綠色熒光；取感染細(xì)胞超薄切片進(jìn)行電子顯微鏡觀察，細(xì)胞漿中發(fā)現(xiàn)大量成熟和未成熟的痘病毒顆粒；將感染細(xì)胞培養(yǎng)物提取總DNA樣本，采用針對(duì)P32結(jié)構(gòu)蛋白基因

3、和ITR非編碼區(qū)基因的兩對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定，分別擴(kuò)增出969bp和289bp的DNA片段，對(duì)目的DNA片段的測(cè)序結(jié)果證實(shí)感染細(xì)胞培養(yǎng)物中存在GPV特異性的病原核酸；采用2000TCID50的病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)皮下接種3月齡健康山羊，在14～45d成功復(fù)制出與山羊痘自然病例相類(lèi)似的臨床癥狀和剖檢病變，并從感染組織材料中回收到接種的病毒。
　　對(duì)GPV結(jié)構(gòu)蛋白P32基因和非編碼區(qū)ITR基因的兩對(duì)引物進(jìn)行比較，以期開(kāi)展臨床山羊痘病

4、例的定性PCR檢測(cè)。研究結(jié)果表明兩對(duì)引物具有羊痘病毒屬特異性，不與副痘病毒屬羊傳染性膿皰病毒、禽痘病毒屬雞痘病毒、健康山羊皮膚樣本發(fā)生交叉反應(yīng)。貴州分離毒P32基因和ITR基因與國(guó)內(nèi)外參考毒株的核苷酸同源性分別達(dá)99.5％～100％和100％；PCR最小檢出量分別為19.06ng和24.40ng。為此，ITR基因引物更適合于臨床山羊痘病例的診斷，而P32基因則有利于病毒囊膜表面蛋白的深入研究。
　　根據(jù)GPV參考毒株的全基因序列，

5、針對(duì)gp064基因分別設(shè)計(jì)與合成了TaqMan-MGB探針和引物，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR方法開(kāi)展對(duì)山羊痘病例的定量檢測(cè)。一般PCR方法只能檢測(cè)患羊出現(xiàn)痘疹病變的皮膚和黏膜材料，而FQ-PCR方法則能夠從患羊鼻腔拭子、血液樣本、皮膚、肺、胃、淋巴結(jié)等組織材料中檢出GPV病原核酸。按照本試驗(yàn)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，TaqMan-MGB-FQ-PCR方法的檢測(cè)極限為0.1TCID50的病毒量。檢測(cè)結(jié)果表明在人工復(fù)制山羊痘病例中，不同組織的含毒量呈現(xiàn)皮膚>

6、瘤胃>肺>淋巴結(jié)的趨勢(shì)；接種山羊從第9～15d形成病毒血癥，持續(xù)時(shí)間較短；鼻拭子中從第7～22d均能檢測(cè)到病毒的存在，表明患羊痘疹痂皮和鼻分泌物是山羊痘蔓延擴(kuò)散的主要傳染源。應(yīng)用FQ-PCR方法在皮膚痘疹病變出現(xiàn)之前3～5d即可檢測(cè)病毒的增殖動(dòng)態(tài)，為山羊痘的早期診斷提供了實(shí)用的技術(shù)。
　　對(duì)山羊痘現(xiàn)場(chǎng)自然病例和人工復(fù)制病例進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察，患病羊群的大體病變以皮膚、呼吸道和消化道黏膜出現(xiàn)痘疹為特征；病變部位上皮細(xì)胞增生、變性，同

7、時(shí)出現(xiàn)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；受害細(xì)胞胞漿內(nèi)觀察到線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、高爾基復(fù)合體擴(kuò)張甚至破裂。在感染細(xì)胞的胞漿中觀察到大量成熟和未成熟的痘病毒顆粒，包括形態(tài)較大，被膜完整或不完整，呈C形或花瓣?duì)畹某跗诓《绢w粒；在中央或偏中央部位開(kāi)始形成致密類(lèi)核體的中期病毒顆粒；和形態(tài)較小，有囊膜包裹，中央可見(jiàn)兩面凹陷呈啞鈴形核酸芯髓的成熟期痘病毒顆粒。
　　將GPV-QL、GPV-LD、GPV-Y和GPV-B毒株的P

8、32基因克隆至pMD18-T載體，重組質(zhì)粒測(cè)序和序列分析顯示，GPV貴州分離株之間核苷酸同源性高達(dá)99.9％，與國(guó)內(nèi)其它GPV分離株的核苷酸同源性達(dá)到99.7％～100％，與國(guó)外GPV分離株核苷酸同源性達(dá)到99.5％～99.6％。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析顯示羊痘病毒屬中SPV與LSDV之間親緣關(guān)系較近，聚為一類(lèi)，而它們與GPV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，后者聚為一類(lèi)，不同毒株之間表現(xiàn)出明顯的種間差異和地域關(guān)系。P32蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、親水性、抗原指數(shù)、柔韌性、表

9、面可及性和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，GPVP32蛋白基因在肽段227-251區(qū)域存在一個(gè)潛在的優(yōu)勢(shì)抗原表位。
　　以pMD18-T-P32/LD質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增P32基因不同長(zhǎng)度的片段并克隆至表達(dá)載體，構(gòu)建原核重組表達(dá)載體和真核重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至相應(yīng)的宿主菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，P32基因N端1/3片段和中間1/3片段未能通過(guò)原核表達(dá)載體pET-28a、畢赤酵母真核表達(dá)載體pPICZαA在各自宿主菌BL21(DE3)、X-33中

10、獲得表達(dá)；而P32全基因在兩種表達(dá)系統(tǒng)中均獲得了良好的表達(dá)，SDS-PAGE和Western-Blotting分析顯示表達(dá)蛋白分子量分別為35.5KD和64KD。表達(dá)蛋白通過(guò)Ni柱親和層析和Sephadex G-100層析獲得純化，該純化蛋白在瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中與山羊痘陽(yáng)性血清出現(xiàn)特異性的沉淀線，而與陰性血清不發(fā)生反應(yīng)；采用純化蛋白接種家兔制備免疫血清，該免疫血清使山羊痘病毒感染力減少50％的中和指數(shù)達(dá)到1:123.07。采用純化的P32蛋