無篩板型固相萃取柱的制備及其在食品中苯甲酸的測定研究

1、<p>　　無篩板型固相萃取柱的制備及其在食品中苯甲酸的測定研究</p><p>　　作者：宋文青 劉亞雄 王琴 包建民</p><p>　　【摘要】 結(jié)合固相萃取(SPE)盤與含支撐物的SPE柱技術(shù)，制備了一種新型的無篩板型固相萃取柱。以C18填料為例，以話梅樣品為介質(zhì)對其中的苯甲酸進行分析，并用傳統(tǒng)固相萃取小柱平行比較;將SPE與HPLCUV結(jié)合，考察了填料對簡單介

2、質(zhì)中苯甲酸的最大吸附量及洗脫曲線，研究了新型SPE柱在實際應用中的分離純化效果。結(jié)果表明，新型SPE柱對樣品的吸附效果更好，規(guī)格為200 mg/3 mL的SPE柱對苯甲酸的吸附量達到0.951 mg，超過了傳統(tǒng)柱的吸附量0.908 mg;其洗脫曲線與傳統(tǒng)柱幾乎重合;苯甲酸在1～100 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， r=0.9999，用此SPE柱純化后的樣品加標回收率和相對誤差分別在88.4%～102.3%和1.4%～2.9%之間。

3、</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 固相萃取柱，篩板，填料，苯甲酸</p><p><b>　　1 引 言</b></p><p>　　固相萃取(SPE)是一種試樣預處理技術(shù)，由液固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來[1]。作為液體試樣制備方法，SPE優(yōu)于傳統(tǒng)的液液萃取法(LLE)，如無乳化現(xiàn)象;不需要使用超純?nèi)軇?，有機溶劑消耗低，對環(huán)境污染小;

4、適用于小體積試樣;處理樣品速率快，尤其適于處理揮發(fā)性及對熱不穩(wěn)定藥物[2,3]。</p><p>　　SPE柱是SPE最普通的使用形式，一般的SPE柱是在類似于注射筒的塑料或玻璃柱管中填裝適量的填料，上下各加一片聚乙烯篩板為支撐體[4]。這種篩板在使用中會產(chǎn)生諸如非特異性吸附和通道效應等問題，影響了萃取效率。SPE盤是SPE的另一種形式。它是通過選擇性質(zhì)穩(wěn)定、粘合性好的特定的固化劑，將其與SPE吸附劑相互混合，用

5、特殊的工藝壓制成堅固的圓片。由于吸附劑被固化劑緊密地粘合在一起，減少了吸附劑之間的死體積，在萃取時無通道效應，因而萃取效率得到提高[5,6]。這種盤片一般適用于處理較大體積的液體，但是由于該膜片無支撐體，使用范圍受到了限制。</p><p>　　本研究在現(xiàn)有SPE盤技術(shù)的基礎(chǔ)上，將另一種含支撐體系的SPE柱技術(shù)的思想與之結(jié)合，把填料和支撐物用粘合劑進行固化，制得一種新型整體性填料。利用此填料開發(fā)了一種全新的無篩板

6、SPE小柱并對其各項性能和指標進行了系統(tǒng)的評價。</p><p>　　苯甲酸作為常用的防腐劑廣泛存在于食品中，國家對其使用有嚴格的限量標準，過量使用會對人體產(chǎn)生危害，因而對存在于食品中的苯甲酸的檢測是非常必要的[7,8]。本研究選取存在于不同介質(zhì)中的苯甲酸作為樣品，評價了此種新型 SPE 小柱的色譜能力。無篩板SPE的最大優(yōu)勢表現(xiàn)為：無需多孔篩板的支撐，避免了篩板的非特異性吸附，提高了分離效率和回收率;所利用的惰

7、性材料減少了SPE上樣過程中的多通道溝流效應，提高了分離效率和載樣量; 適用于比常規(guī)SPE填料小得多的超細填料。</p><p><b>　　2 實驗部分</b></p><p><b>　　2.1 儀器與試劑</b></p><p>　　XL30環(huán)境掃描電鏡(Philips公司); 1100高效液相色譜儀(安捷倫公司)

8、;QT6150超聲機(天津市瑞普電子儀器公司);5415c離心機(Eppendorf Centrifuge);傳統(tǒng)和新型的SPE小柱均由天津奧秘科技有限公司提供。</p><p>　　苯甲酸(99%，天津一方科技有限公司);乙酸銨、甲苯、丙酮、二氯甲烷均為分析純，甲醇為色譜純(天津大學科威公司);水為去離子水;九制話梅由商店購得。</p><p><b>　　2.2 色譜條件&l

9、t;/b></p><p>　　FujiC18色譜柱(150 mm×4.6 mm， 5 μm，天津市三維色譜儀器配件廠);流動相：V(甲醇)∶V(0.02 mol/L乙酸銨)=10∶90;流速：0.8 mL/min;檢測波長：230 nm;進樣量：20 μL。</p><p><b>　　2.3 實驗方法</b></p><p&g

10、t;　　2.3.1 碳十八烷基填料的鍵合[9] 取硅膠10.0 g，用6 mol/L HCl進行酸洗后，抽吸過濾，蒸餾水洗至洗出液呈中性，烘干。將處理好的硅膠放入三口燒瓶中，固定在油浴上，右側(cè)接滴液漏斗，內(nèi)裝十八烷基三氯硅烷13.6 mL和甲苯20.0 mL，漏斗上端封閉，左側(cè)接真空泵。開啟真空泵抽真空2 h，使油浴溫度控制在150 ℃。加熱完畢后，待油浴溫度降至50 ℃左右，關(guān)閉真空泵，邊攪拌邊緩慢加入硅烷化試劑和甲苯混合液，右側(cè)加入

11、0.5 mL三乙胺后，左側(cè)立刻通入N2，右側(cè)連接冷凝裝置，啟動加熱開關(guān)，控制反應液溫度130 ℃，連續(xù)回流反應3 h。冷卻至室溫。抽濾，依次以甲苯、甲醇、二氯甲烷洗滌硅膠2次，最后用丙酮洗滌抽濾，將硅膠放入電熱真空干燥箱(80 ℃，0.04 MPa，3 h)，冷卻至室溫即得產(chǎn)品。</p><p>　　2.3.2 新型填料的制備及表征 取適量C18填料，依照不同產(chǎn)品性能的要求調(diào)整不同比例(如20%～30%)結(jié)構(gòu)性添

12、加物的復合粘合劑，在充分混勻后，加壓成型，即可得此具有整體性的填料。將兩種填料徹底干燥后進行電鏡掃描，可看出表面結(jié)構(gòu)的差異，放大倍數(shù)為100倍。</p><p>　　2.3.3 填裝 傳統(tǒng)固相萃取是時將填料裝填在兩個擋板之間，而新型固化填料無需擋板，直接裝填壓勻即可使用。每種小柱都分別裝有200 mg/3 mL，500 mg/6 mL兩種規(guī)格。</p><p>　　2.3.4 苯甲酸的吸附

13、測定 以0.02 mol/L 乙酸銨水溶液為溶劑，分別配制1.0和2.0 g/L的苯甲酸溶液。取1.0 g/L樣品溶液1 mL 通過已用3 mL 甲醇和3 mL 水清洗活化了的規(guī)格為200 mg/3 mL的SPE柱，3 mL甲醇洗脫，流速1 mL/min，結(jié)合 HPLC按外標法測定洗脫液中苯甲酸的含量;再分別取2.0 g/L樣品溶液1 mL 通過已活化的規(guī)格為500 mg/6 mL 的SPE柱，5 mL甲醇洗脫1.0 g/L苯甲酸溶液，

14、同法進行定量測定。比較兩種SPE柱對苯甲酸的吸附值。</p><p>　　取1.0 g/L苯甲酸溶液1.0，1.2，1.4，1.6，1.7及1.8 mL，分別通過已活化的規(guī)格為200 mg/3 mL的SPE柱，3 mL甲醇洗脫，流速為1 mL/min;另取2.0，3.0，4.0，4.5，4.8和5.0 mL的1.0 g/L苯甲酸溶液，分別通過已活化的規(guī)格為500 mg/6 mL的SPE柱，5 mL甲醇洗脫，流速為

15、1 mL/min，同法進行定量測定，計算出兩種SPE 小柱對苯甲酸的最大吸附值。</p><p>　　以0.02 mol/L 乙酸銨水溶液為溶劑，配制200 mg/L 苯甲酸樣品溶液。取1 mL分別通過兩種已活化的SPE柱(200 mg/3 mL)，再依次用水、10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%及100%甲醇水溶液洗脫，洗脫液體積為3 mL，流速為1 mL/min，HPLC定量

16、測定，計算出兩種SPE小柱的累積洗脫量。</p><p>　　2.3.5 復雜介質(zhì)中苯甲酸含量的測定 配制濃度為1.0，5.0，25.0，50.0和100.0 mg/L 苯甲酸標準溶液。經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后分別取20 μL 注入色譜儀，測定峰面積，以峰面積對濃度作曲線。取10.0 g話梅肉于50 mL 小燒杯中，加去離子水25 mL，超聲提取10 min，4000 r/min離心10 min，取上清液，去

17、離子水定容至30 mL [10]。分別取上述溶液2 mL通過已活化的規(guī)格為500 mg/6 mL的兩種SPE柱，用5 mL 70%甲醇水溶液以1 mL/min流速分析洗脫，收集洗脫液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，待測。</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論</b></p><p><b>　　3.1 填料的表征</b></p>

18、<p>　　由圖1可見,傳統(tǒng)C18填料顆粒之間具有一定的空隙(圖1a);而添加了粘合劑的C18填料(固化后)顆粒緊密地聚集在一起(圖1b)，上樣以后避免了多通道溝流的形成。</p><p>　　3.2 簡單介質(zhì)中苯甲酸的測定</p><p>　　3.2.1 填料對苯甲酸吸附能力的測定 以苯甲酸為分析物，乙酸銨水溶液為溶劑，考察了不同規(guī)格SPE小柱對不同濃度樣品的吸附，每個規(guī)格

19、4個柱子平行測試(柱規(guī)格為200 mg/3 mL)。結(jié)果顯示，添加了粘合劑的新型SPE小柱對苯甲酸的平均吸附量為0.951 mg, 優(yōu)于傳統(tǒng)的SPE小柱平均吸附量0.908 mg。</p><p>　　當流出液中樣品含量超過加入量的10%時，通常視為小柱達到最大吸附量?？疾炝诵滦蚐PE 小柱與傳統(tǒng)SPE小柱對苯甲酸的最大吸附量，結(jié)果見圖2。兩種規(guī)格的新型SPE柱的吸附量均較傳統(tǒng)柱略高。</p>&l

20、t;p>　　3.2.2 洗脫曲線的測定 如圖3所示，隨著甲醇比例的增加，洗脫率逐漸提高，以3 mL 40%甲醇水溶液基本可以將苯甲酸完全洗脫。兩種類型的SPE小柱在同時經(jīng)歷不同洗脫液條件直接對比下，對于苯甲酸的吸附幾乎是相同的，表明新型SPE小柱的色譜性能未受影響。</p><p>　　3.3 復雜介質(zhì)中苯甲酸的測定</p><p>　　苯甲酸在1～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好

21、，其回歸方程為Y=87.229X(mg/L)-7.503，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。</p><p>　　1. 新型SPE (Novel SPE); 2. 傳統(tǒng)SPE (Traditional SPE)。通過比較未經(jīng)SPE小柱預處理話梅樣品的HPLC 譜圖以及分別用兩種SPE 小柱純化了的樣品HPLC譜圖來評價新型SPE 小柱對于預處理復雜樣品的能力(見圖4)。新型SPE小柱的分離純化效果更好，測得話梅中苯甲酸含

22、量3.05 mg/L(見表1)。</p><p>　　圖4 未經(jīng)SPE柱純化的樣品溶液(a)，經(jīng)新型SPE柱純化的樣品溶液(b)和經(jīng)傳統(tǒng)SPE柱純化的樣品溶液(c)的HPLC譜圖</p><p>　　Fig.4 Chromatogram of sample without purification(a), sample purificated with novel SPE(b) and s

23、ample purificated with traditional SPE(c)表1 經(jīng)不同種SPE純化后所得色譜圖峰面積</p><p>　　3.4 方法精密度與加標回收率</p><p>　　選用待測話梅樣品，分別加入0.1，0.5和1.0 g/kg的苯甲酸標準溶液，按照2.3.5節(jié)的方法處理樣品。每個濃度水平測定5次，分別計算其方法的精密度及加標樣品的平均回收率(n=5)，將新型S

24、PE柱與傳統(tǒng)SPE柱比較(SPE柱規(guī)格為500 mg/6 mL)，結(jié)果見表2。經(jīng)新型SPE柱純化的樣品的添加回收率在88.4%～102.3%之間，RSD值小于2.9%。結(jié)果表明，所制備新型 SPE 柱具有較好的分離純化能力。表2 方法精密度與回收率</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　1 Johanna Tollback, Maria

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