重金屬類(lèi)化合物的聯(lián)合毒性研究[畢業(yè)設(shè)計(jì)]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　?。ǘ?屆）</b></p><p>　　重金屬類(lèi)化合物的聯(lián)合毒性研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 生物工程 </

2、p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要: 本文主要研究各種重金屬對(duì)明亮發(fā)光菌T3的單一及聯(lián)合毒性。測(cè)定了Co、Cu、

3、Ba、Ni這四種重金屬對(duì)發(fā)光菌的單一毒性，在測(cè)定重金屬單一毒性的基礎(chǔ)上，分別測(cè)定了二元重金屬?gòu)?fù)合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性，并采用毒性單位法和指數(shù)相加法對(duì)聯(lián)合毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。</p><p>　　關(guān)鍵詞: 重金屬；明亮發(fā)光菌T3；單一毒性；聯(lián)合毒性。</p><p>　　The study of joint toxicity for heavy metal compounds</p>

4、;<p>　　Abstract: This paper mainly studies single and joint toxicity of all sorts of heavy metal to photobacterium phosphoreum T3. Measure the single toxicity of four heavy metal Cu, Ba, Co, Ni to photobacterium p

5、hosphoreum T3, and on the basis of the results, measure the joint toxicity of two kinds of heavy metal to Photobacterium phosphoreum T3. Using toxic unit method and index addition method to evaluate joint toxicity.</p

6、><p>　　Keywords: heavy metal; photobacterium phosphoreum T3; single toxicity; joint toxicity 目 錄</p><p><b>　　摘要I</b></p><p>　　AbstractII</p><p><b>　　

7、1 緒論1</b></p><p>　　1.1 選題背景及意義1</p><p>　　1.2 EC50的概念2</p><p>　　1.3 相關(guān)研究的最新成果及動(dòng)態(tài)3</p><p>　　1.3.1 單一毒性研究3</p><p>　　1.3.2 聯(lián)合毒性研究4</p>&l

8、t;p>　　1.4 研究的技術(shù)方法難點(diǎn)6</p><p>　　1.4.1 課題研究?jī)?nèi)容6</p><p>　　1.4.3 難點(diǎn)6</p><p>　　1.4.4 研究目的6</p><p>　　1.5 研究的創(chuàng)新點(diǎn)6</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)部分7</b><

9、;/p><p>　　2.1 試劑與儀器7</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法8</p><p>　　2.2.1發(fā)光菌的培養(yǎng)8</p><p>　　2.2.2毒性測(cè)定8</p><p>　　2.3 計(jì)算方法9</p><p>　　2.4 實(shí)驗(yàn)流程10</p><

10、p>　　3 結(jié)果與分析12</p><p>　　3.1 單一毒性的測(cè)定12</p><p>　　3.2 聯(lián)合毒性測(cè)定12</p><p><b>　　3.3 小結(jié)15</b></p><p><b>　　4 結(jié)論16</b></p><p><b&g

11、t;　　參考文獻(xiàn)17</b></p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 選題背景及意義 </p><p>　　隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的不斷發(fā)展，大量有毒有害的有機(jī)化學(xué)品和重金屬的使用，它們同時(shí)或先后進(jìn)入環(huán)境，通過(guò)各種物理運(yùn)輸途

12、徑直接或間接進(jìn)入水體，并在水體中共存，對(duì)水環(huán)境構(gòu)成了復(fù)合污染。這此污染物嚴(yán)重地威脅著生態(tài)環(huán)境和人體健康，其中農(nóng)藥類(lèi)就是最常見(jiàn)的環(huán)境污染物之一。其中，酚類(lèi)化合物在染料、炸藥、農(nóng)藥等生產(chǎn)中具有重要的地位，是重要的化工原料或中間體，而且其作為原生質(zhì)毒物，屬于高毒性物質(zhì)，對(duì)一切生物個(gè)體都有毒害作用。酚的毒性直接影響對(duì)水的飲用和水產(chǎn)養(yǎng)殖，還可以強(qiáng)烈地抑制水體其它生物如細(xì)菌、海藻和軟體動(dòng)物等的自然生長(zhǎng)速度，有時(shí)甚至?xí)顾鼈兺Ｖ股L(zhǎng)，對(duì)人體更具有潛在

13、的致癌性。因此酚類(lèi)化合物對(duì)環(huán)境的污染一直被人們所關(guān)注。</p><p>　　長(zhǎng)期以來(lái)，我們對(duì)毒理學(xué)的研究對(duì)象大多是單一化學(xué)品或重金屬，而對(duì)多種化合物或重金屬共同作用引起的復(fù)合污染研究較少。然而實(shí)際表明，僅用單一化學(xué)品的毒性效應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)是不夠的，因?yàn)樵诙鄶?shù)情況下，兩種或多種化學(xué)物質(zhì)共同作用于生物體時(shí)，會(huì)引起與各物質(zhì)單獨(dú)作用時(shí)完全不同的毒性效應(yīng)，即毒理學(xué)中所稱(chēng)的聯(lián)合作用。因此，研究?jī)煞N或多種化學(xué)物質(zhì)的聯(lián)合毒性效應(yīng)能為環(huán)

14、境標(biāo)準(zhǔn)的制定和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供更科學(xué)、更可靠的依據(jù)，更具實(shí)際及應(yīng)用的意義。其中，重金屬污染具有范圍廣，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，不易在生物物質(zhì)循環(huán)和能量交換中分解，可在環(huán)境中長(zhǎng)期存在，只會(huì)發(fā)生形態(tài)和價(jià)態(tài)變化，并能沿食物鏈轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，在毒理學(xué)的研究中具有重要意義。</p><p>　　重金屬污染與其他有機(jī)化合物的污染不同。不少有機(jī)化合物可以通過(guò)自然界本身物理的、化學(xué)的或生物的凈化，使有害性降低或解除。而重金屬具有富集性，很難在環(huán)

15、境中降解。目前我國(guó)由于在重金屬的開(kāi)采、冶煉、加工過(guò)程中，造成不少重金屬如鉛、汞、鎘、鈷等進(jìn)入大氣、水、土壤，引起嚴(yán)重的環(huán)境污染。如隨廢水排出的重金屬，即使?jié)舛刃。部稍谠孱?lèi)和底泥中積累，被魚(yú)和貝類(lèi)體表吸附，產(chǎn)生食物鏈濃縮，從而造成公害。 水體中金屬有利或有害不僅取決于金屬的種類(lèi)、理化性質(zhì)，而且還取決于金屬的濃度及存在的價(jià)態(tài)和形態(tài)，即使有益的金屬元素濃度超過(guò)某一數(shù)值也會(huì)有劇烈的毒性，使動(dòng)植物中毒，甚至死亡。金屬有機(jī)化合物(如有機(jī)汞、有機(jī)鉛

16、、有機(jī)砷、有機(jī)錫等)比相應(yīng)的金屬有機(jī)化合物毒性要強(qiáng)得多；可溶態(tài)的金屬又比顆粒態(tài)金屬的毒性要大；六價(jià)鉻比三價(jià)鉻毒性要大等等。</p><p>　　重金屬在人體內(nèi)能和蛋白質(zhì)及各種酶發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使它們失去活性，也可能在人體的某些器官中富集，如果超過(guò)人體所能耐受的限度，會(huì)造成人體急性中毒、亞急性中毒、慢性中毒等，對(duì)人體會(huì)造成很大的危害，例如，日本發(fā)生的水俁病(汞污染)和骨痛病(鎘污染)等公害病，都是由重金屬污染引

17、起的。</p><p>　　重金屬在大氣、水體、土壤、生物體中廣泛分布，而底泥往往是重金屬的儲(chǔ)存庫(kù)和最后的歸宿。當(dāng)環(huán)境變化時(shí)，底泥中的重金屬形態(tài)將發(fā)生轉(zhuǎn)化并釋放造成污染。重金屬不能被生物降解，但具有生物累積性，可以直接威脅高等生物包括人類(lèi)，有關(guān)專(zhuān)家指出，重金屬對(duì)土壤的污染具有不可逆轉(zhuǎn)性，已受污染土壤沒(méi)有治理價(jià)值，只能調(diào)整種植品種來(lái)加以回避。因此，底泥重金屬污染問(wèn)題日益受到人們的重視。</p><

18、;p>　　重金屬污染目前已相當(dāng)嚴(yán)重，其對(duì)環(huán)境和生物的危害極大，同時(shí)，其易通過(guò)食物鏈而富集，因此，已經(jīng)引起了世界各國(guó)科學(xué)家的高度重視，解決這個(gè)問(wèn)題已迫在眉睫。</p><p>　　目前，細(xì)菌、藻類(lèi)、浮游生物、植物、昆蟲(chóng)和魚(yú)類(lèi)等多種生物體的試驗(yàn)被用于環(huán)境毒性的評(píng)定。在這些方法中，發(fā)光菌毒性試驗(yàn)因其方便、靈敏、高效而被廣泛應(yīng)用。而且化合物對(duì)發(fā)光菌的毒性與對(duì)其它生物的毒性數(shù)據(jù)有一定的相關(guān)性。因此，該方法對(duì)有毒化學(xué)品

19、的篩選和評(píng)價(jià)具有重要意義，也為研究化合物對(duì)其它生物的毒性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。</p><p>　　1.2 EC50的概念</p><p>　　半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)：指引起受試對(duì)象50%個(gè)體產(chǎn)生一種特定效應(yīng)的藥物劑量。目前，毒性實(shí)驗(yàn)中采用的指示生物主要是水生生物，常見(jiàn)的有線蟲(chóng)、發(fā)光菌(Photobacterium phosphoreum)、大型蚤(Daphnia magna)、藻類(lèi)(如綠藻

20、)和大型藻、魚(yú)類(lèi)(如鏈魚(yú)、草魚(yú)、青魚(yú)、金魚(yú)、鯉魚(yú)、呆條魚(yú)和黃姑魚(yú)等)、蝌蚪、幼蝦和夏吸蟲(chóng)等，也包括土壤動(dòng)物如蚯蚓。發(fā)光菌法是以發(fā)光菌作指示生物的毒性測(cè)試方法，其發(fā)光強(qiáng)度的變化與毒物濃度呈線性相關(guān)[1]，可以在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量化合物的毒性測(cè)定。該法具有靈敏、快速、簡(jiǎn)便和費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞，在有毒物質(zhì)的篩選和環(huán)境污染生物學(xué)評(píng)價(jià)等方面具有重要意義。采用發(fā)光菌法測(cè)定水生生物毒性的技術(shù)已比較成熟，有關(guān)這方面的研究有較多成功的例子[2, 3]

21、。</p><p>　　該法具有靈敏、快速、簡(jiǎn)便和費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞，在有毒物質(zhì)的篩選和環(huán)境污染生物學(xué)評(píng)價(jià)等方面具有重要意義。采用發(fā)光菌法測(cè)定水生生物毒性的技術(shù)已比較成熟，有關(guān)這方面的研究有較多成功的例子。Faust等[4,5]人首先用18種具有相似模式的三嗪類(lèi)化合物進(jìn)行了對(duì)藻類(lèi)的聯(lián)合毒性分析,接著用16種具有相異作用模式的生物滅殺劑對(duì)藻類(lèi)進(jìn)行聯(lián)合毒性分析。</p><p>　　1.3

22、 相關(guān)研究的最新成果及動(dòng)態(tài)</p><p>　　1.3.1 單一毒性研究</p><p>　　重金屬單一毒性研究開(kāi)始的較早，其研究方法比較成熟，也得到了很多的成果。</p><p>　　近年來(lái)，楊帆、鄒容[6]在室內(nèi)常溫靜水條件下，采用氯化鎘、硫酸銅、硝酸亞汞3種重金屬鹽類(lèi)對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)進(jìn)行了毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，3種藥物的毒性強(qiáng)弱依次為：硝酸亞汞>硫酸銅&g

23、t;氯化鎘。宋玉芳等[7]在土壤重金屬污染對(duì)蚯蚓的急性毒性效應(yīng)研究中，測(cè)定了在草甸棕壤條件下，Cu、Zn、Pb、Cd單一污染對(duì)蚯蚓的急性致死及亞致死效應(yīng)。結(jié)果表明，Cu、Pb濃度與蚯蚓死亡率顯著相關(guān)，Cu濃度與生長(zhǎng)抑制率顯著相關(guān)，其他供試重金屬濃度與蚯蚓死亡率和生長(zhǎng)抑制率相關(guān)性不顯著。譚鳳霞等[8]在研究重金屬對(duì)稀有絢鯽的毒性作用中發(fā)現(xiàn)，稀有絢鯽細(xì)胞系RMF胞對(duì)4種重金屬毒性的敏感性均表現(xiàn)出隨著傳代代數(shù)的增大而下降的趨勢(shì)，但20代之內(nèi)未

24、發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。</p><p>　　李偉強(qiáng)等[9]測(cè)定了Hg2+、Cd2+、Cu2+、Pb2+單一重金屬脅迫對(duì)擬南芥種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，重金屬對(duì)幼苗生長(zhǎng)的毒性大于對(duì)種子發(fā)芽的毒性，以抑制種子發(fā)芽的IC50為指標(biāo)，4種重金屬的毒性順序?yàn)镠g2+>Cd2+>Pb2+>Cu2+，以幼苗生長(zhǎng)為指標(biāo)，則毒性順序?yàn)椋篊u2+>Hg2+>Cd2+>Pb

25、2+，并隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)種子萌發(fā)率下降。此外，不同重金屬在不同發(fā)芽時(shí)段對(duì)種子的毒性也不盡相同，Cd2+的毒性在種子吸水后的0～12 h大于12～24 h，而Hg2+毒性在12～24 h大于0～12 h，其中，種皮對(duì)減輕重金屬毒性起著十分重要的作用。王勝?gòu)?qiáng)等[10]用泥鰍進(jìn)行長(zhǎng)期暴露試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)河流底泥重金屬的毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，底泥重金屬的污染程度增加，死亡率增加，血紅細(xì)胞變異程度加大。</p><p>　　李娟英

26、等[11]采用發(fā)光細(xì)菌毒性、活性污泥脫氫酶毒性、硝化抑制毒性3種方法測(cè)定Hg、Cd、Zn、Pb這4種重金屬對(duì)活性污泥微生物的毒性。結(jié)果表明，發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)定方法的靈敏度最高，測(cè)得的重金屬半數(shù)有效濃度(EC50)最低，4種重金屬對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制程度由大到小順序依次為Hg>Cd>Zn>Pb；活性污泥脫氫酶毒性和硝化抑制毒性的測(cè)定結(jié)果與發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)定結(jié)果相比，靈敏度相對(duì)較低，測(cè)得的活性污泥脫氫酶活性的抑制程度由大到

27、小順序依次為Cd>Hg>Zn>Pb。為了更準(zhǔn)確的判定重金屬對(duì)活性污泥微生物的毒性影響，至少應(yīng)取不同的重金屬毒性終點(diǎn)指示指標(biāo)做一組毒性實(shí)驗(yàn)，而不能以發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)定結(jié)果作為唯一的判定依據(jù)，這可能會(huì)過(guò)分夸大重金屬對(duì)污水處理工藝的沖擊能力，導(dǎo)致污水處理成本無(wú)謂增加。</p><p>　　楊麗華等[12]采用靜水法生物測(cè)試研究了銅、鋅、鎘和鉻對(duì)豐產(chǎn)鯽幼魚(yú)的急性毒性，結(jié)果表明，銅對(duì)鯽魚(yú)為劇毒物質(zhì)，鎘為中毒

28、物質(zhì)，鋅和鉻為低毒物質(zhì)，4種重金屬毒性大小順序依次為Cu>Cd>Zn>Cr。銅對(duì)鯽魚(yú)的安全質(zhì)量濃度略低于漁業(yè)水域水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，鋅、鎘和鉻的安全質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)。張才學(xué)等[13]研究了銅、鋅、鎘、鉛離子對(duì)壺狀臂尾輪蟲(chóng)的急性毒性影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其對(duì)壺狀臂尾輪蟲(chóng)的急性毒性的大小順序?yàn)镃u2+>Zn2+>Cd2+>Pb2+。許章程[14]研究了 Hg2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+4種重金屬對(duì)海洋單胞藻

29、鈣質(zhì)角毛藻的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明，不同重金屬對(duì)單胞藻的毒性效應(yīng)有所不同，其毒性為Hg2+>Cu2+>Zn2+>Cd2+。</p><p>　　1.3.2 聯(lián)合毒性研究</p><p>　　早在上世紀(jì)70年代末期，人們就意識(shí)到混合物的聯(lián)合污染問(wèn)題。研究表明，混合物中，即使化合物的濃度水平較低(0.02LC50)，它們的毒效也是很大的[15]。因此，化學(xué)混合物的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)受到關(guān)

30、注，環(huán)境工作者相繼展開(kāi)多方面的聯(lián)合毒性研究，并按照不同的劃分方法，對(duì)各組物質(zhì)的聯(lián)合作用進(jìn)行分類(lèi)及評(píng)價(jià)。</p><p>　?。?）不同化合物間聯(lián)合作用表征和聯(lián)合效應(yīng)研究。由于重金屬的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，因此在重金屬之間的聯(lián)合作用[16-17]方面的研究相對(duì)興起較早，得到的結(jié)論也較多、較成熟。在同系列有機(jī)物間的聯(lián)合毒性[18]方面，由于同系列化合物的結(jié)構(gòu)相似，它們對(duì)生物體的單一作用機(jī)制也相近，所以，不論反應(yīng)型還是非反應(yīng)型

31、毒物，只要其作用機(jī)制相同，聯(lián)合毒性往往是相加或是拮抗。而在不同有機(jī)物之間的聯(lián)合作用[19-20]方面，由于有機(jī)化合物的種類(lèi)較繁多、差異較大，因此，涉及到不同類(lèi)別有機(jī)物的聯(lián)合毒性效應(yīng)往往是很復(fù)雜的。</p><p>　?。?）不同化合物聯(lián)合毒作用機(jī)理方面的研究。這部分研究相對(duì)比較困難，進(jìn)展緩慢，但是經(jīng)過(guò)多年的不懈努力，環(huán)境工作者利用各種技術(shù)手段還是取得了不小的成果。其中，重金屬聯(lián)合作用機(jī)理的探討是比較成熟的。研究者

32、發(fā)現(xiàn)：毒物對(duì)生物的毒性一方面取決于受試生物的敏感性，另一方面也取決于該毒物的濃度及其生物可利用性；金屬化合物的陰離子不同，其生物可利用性也有差異，因此導(dǎo)致相同的重金屬離子對(duì)同一受試生物的毒性也可能有差異。大部分的常規(guī)聯(lián)合毒性分類(lèi)只是提出化合物的潛在毒性，最終的毒性分級(jí)還要結(jié)合生物降解和生物蓄積性。這一點(diǎn)是在以往的研究工作中并未涉及、在以后工作中需注意的。</p><p>　?。?）聯(lián)合毒性研究進(jìn)展。余江、楊宇峰[

33、21]從生理生化特性及抗氧化防御等方面，研究龍須菜對(duì)鎘(Cd)和鄰甲酸二甲酯(DMP)聯(lián)合作用(以下用Cd／DMP表示)的脅迫響應(yīng)。結(jié)果顯示，龍須菜生長(zhǎng)受Cd／DMP聯(lián)合質(zhì)量濃度和暴露時(shí)間的影響。當(dāng)Cd和DMP質(zhì)量濃度分別小于1.5 mg／L和O.2 mg／L時(shí)，葉綠素(Chl.a)、藻紅素(PE)及可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，硝酸還(NR)、過(guò)氧化物酶(POD)及過(guò)氧化氫酶(CAT)活性短時(shí)間內(nèi)

34、以誘導(dǎo)為主；當(dāng)Cd和DMP質(zhì)量濃別超過(guò)1．5 mg／L和O．2 mg／L，尤其是Cd和DMP的質(zhì)量濃度分別大于3．0 mg／L和O．4 mg／L時(shí)，Chl.a和PE質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨Cd／DMP質(zhì)量濃度的升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯下降趨勢(shì)(P<0.001)，而MDA呈明升趨勢(shì)，NR、POD和CAT活性受到顯著抑制，龍須菜生長(zhǎng)受到明顯抑制，藻體表現(xiàn)出發(fā)黃發(fā)白等表狀。王志錚等[22]以彩虹明櫻蛤養(yǎng)殖殼高優(yōu)勢(shì)組(平均殼高為17.35 1.01m

35、m)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行4種重金屬離子Hg2+、Cr6+、Cu2+、Zn2+對(duì)彩虹明櫻蛤的加和等毒性</p><p>　　鄒佩貞等[23]在水溫24—26℃條件下，采用半靜止式生物毒性實(shí)驗(yàn)法，分析Cu2+、Cd2+、Pb2+、Zn2+對(duì)光倒刺鲃胚胎發(fā)育的聯(lián)合毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，在各種不同濃度的重金屬離子溶液實(shí)驗(yàn)組中胚胎的孵化率均較低，與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)；各種重金屬在胚胎發(fā)育過(guò)程中引起各種畸形；Cu

36、2+與Cd2+對(duì)光倒刺鈀胚胎的聯(lián)合毒性為拮抗作用。陳桂葵等[24]以靜水生物測(cè)試法研究了氯酸鉀和重金屬砷、鎘對(duì)蝌蚪的聯(lián)合毒性，試驗(yàn)結(jié)果表明，KClO3與Cd2+、KCl03與As3+共存時(shí)的聯(lián)合毒性為協(xié)同作用，而Cd2+與As3+的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用。王瑩等[25]水螅為實(shí)驗(yàn)生物，采用相加指數(shù)法研究了鉛、鎘和鋅3種重全屬離子復(fù)合污染物的聯(lián)合毒性，結(jié)果表明，鉛和鋅共存時(shí)的聯(lián)合毒性為拮抗作用，而鎘和鋅，鎘和鉛共存時(shí)主要表現(xiàn)為毒性劇增的協(xié)

37、同作用。鉛、鎘和鋅三者共存時(shí)的聯(lián)合毒性較為復(fù)雜，三者濃度比1：1：1時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同作用，而毒性比1：1：1時(shí)表現(xiàn)曲拮抗作用。</p><p>　　江敏等[26]研究了Cu、Zn、Cr、Cd四種重金屬離于對(duì)羅氏沼蝦仔蝦的聯(lián)合毒性作用，結(jié)果表明，Cu2+和Zn2+、Zn2+和Cd2+對(duì)羅氏錯(cuò)蝦仔蝦的聯(lián)合作用表現(xiàn)為拮抗，Cu2+和Cd2+、Cu2+和Cr6+、Zn2+和Cr(Ⅵ)則為協(xié)同作用。歐小兵等[27]研究了重金屬

38、銅(Cu2+)、鎘(Cd2+)對(duì)水螅的聯(lián)合毒性作用，探索水螅對(duì)兩者混合的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，水螅對(duì)兩種重金屬的毒性反應(yīng)既快速又敏感，等毒性配比的兩種重金屬混合液對(duì)水螅的毒性大于單一毒性，為協(xié)同作用。湯保華等[28]研究了五溴聯(lián)苯醚(Penta—BDE)與重金屬鎘(Cd)、銅(Cu)對(duì)水生甲殼類(lèi)動(dòng)物大型蚤Daphnia magna的48 h存活以及21d繁殖的聯(lián)合毒性影響，結(jié)果表明在聯(lián)合毒性中，Cu和Cd的毒性作用大于Pe—BDE。張青田

39、和胡桂坤[29]研究了Hg2+、Pb2+、Cu2+、Mn2+和Cd2+5種重金屬離子對(duì)俄羅斯鹵蟲(chóng)的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，Pb2+和Cu2+表現(xiàn)出協(xié)同作用，Hg2+與Cd2+、Cu2+和Cd2+、Hg2+和Cu2+表現(xiàn)出拮抗作用，同時(shí)Pb2+和Mn2+也存在交互作用。</p><p>　　鄧鐵柱等[30]研究了乙草胺與Cu，Zn(以毒性單位配比為l：1，1：4和4：1以及l(fā)：1：1構(gòu)成的二元或三元混合體系)對(duì)發(fā)光菌和

40、斑馬魚(yú)胚胎的聯(lián)合毒性，結(jié)果表明，同種物質(zhì)混合毒性配比不同時(shí)，對(duì)生物的聯(lián)合毒性作用不完全相同；不同的混合體系對(duì)發(fā)光苗和斑馬魚(yú)胚胎表現(xiàn)出不同的聯(lián)合毒性效應(yīng)，乙草胺與重金屬對(duì)發(fā)光苗的聯(lián)合毒性主要以拈抗為主，對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的聯(lián)合毒性則主要以協(xié)同為主，說(shuō)明受試生物不同，其對(duì)化合物的敏感性不同。王麗平等[31]在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了多環(huán)芳烴熒蒽和銅對(duì)三角褐指藻的聯(lián)合毒性，結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)所測(cè)試的濃度范圍內(nèi)，熒蒽和銅混合后，對(duì)三角褐指藻的72h EC5

41、0為(1.093±0.085)TU，其聯(lián)合毒性效應(yīng)方式表現(xiàn)為拮抗作用。</p><p>　　1.4 研究的技術(shù)方法難點(diǎn)</p><p>　　1.4.1 課題研究?jī)?nèi)容</p><p>　　本項(xiàng)目的基本研究?jī)?nèi)容包括:</p><p>　　1．發(fā)光菌的活化、保藏；</p><p>　　2. 發(fā)光菌活性測(cè)定方法的建

42、立；</p><p>　　3. 含銅、鈷等重金屬化合物毒性的測(cè)定；</p><p>　　4．含銅、鈷等重金屬化合物聯(lián)合毒性的測(cè)定。</p><p><b>　　1.4.2 難點(diǎn)</b></p><p>　　發(fā)光菌活性測(cè)定方法及聯(lián)合毒性作用評(píng)價(jià)方法涉及到多方面的知識(shí)，如何把握，選擇最合適的方法是本課題的一個(gè)難點(diǎn)。另一方面，

43、聯(lián)合作用機(jī)理研究是進(jìn)行化合物聯(lián)合毒性作用研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)?；衔锏亩鄻有?、物質(zhì)之間相互作用的復(fù)雜性、聯(lián)合效應(yīng)制約因素的多樣性等，決定了其作用機(jī)理的復(fù)雜性和進(jìn)行機(jī)理研究的困難性。</p><p>　　1.4.3 研究目的</p><p>　　得到合理科學(xué)的有關(guān)含汞、鉛等重金屬化合物單一和聯(lián)合毒性測(cè)試的數(shù)據(jù)，為聯(lián)合作用機(jī)理研究提供一個(gè)可靠的根據(jù)，希望對(duì)作用機(jī)理的復(fù)雜性和困難性的理解能幫助。 &

44、lt;/p><p>　　1.5 研究的創(chuàng)新點(diǎn)</p><p>　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到了Co、Cu、Ba、Ni對(duì)明亮發(fā)光桿菌T3的單一毒性EC50值，以及它們兩兩混合的聯(lián)合毒性的大小，采用毒性單位法和指數(shù)相加法分析了其聯(lián)合作用的類(lèi)型。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)部分</b></p><p>　　2.1 試劑與儀器&l

45、t;/p><p>　　主要試劑：重金屬類(lèi)化合物，去離子水等，見(jiàn)表2.1。明亮發(fā)光桿菌T3(由中科院南京土壤研究所提供)。</p><p>　　表2.1 主要試劑表</p><p>　　表2.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備表</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1發(fā)光菌

46、的培養(yǎng)</p><p><b>　　培養(yǎng)液</b></p><p>　　酵母膏 5.0g</p><p>　　胰蛋白胨 5.0g</p><p>　　NaCl 30g</p><p>　　Na2HPO4

47、 5.0g</p><p>　　KH2PO4 1.0g</p><p>　　甘油 3.0g</p><p>　　蒸餾水至 1000mL</p><p>　　pH 7.0±0.5</p><p>&

48、lt;b>　　培養(yǎng)基</b></p><p>　　培養(yǎng)液（按上述配方） 1000mL</p><p>　　瓊酯粉 16g</p><p>　　pH 7.0±0.5</p><p>　　按上訴配方制備培養(yǎng)液和固體培養(yǎng)

49、基，經(jīng)121℃高壓滅菌20-30min后備用，固體培養(yǎng)基制成斜面。配制2.0％NaCl溶液，高溫滅菌后置于冰箱在4℃保存?zhèn)溆?。把發(fā)光菌凍干粉的安培瓶置于冰水中，用已經(jīng)滅菌的1ml注射器在無(wú)菌環(huán)境下吸取0.5ml 2.0％NaCl溶液、注入安培瓶，充分搖勻，2min后菌種即復(fù)蘇發(fā)光。在無(wú)菌環(huán)境下，接種于固體斜面培養(yǎng)基，20℃培養(yǎng)24h，再轉(zhuǎn)接第二代，20℃培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)接第三代，20℃培養(yǎng)24h后于4℃保存?zhèn)溆?。用接種環(huán)取一環(huán)第三代斜

50、面培養(yǎng)的菌種轉(zhuǎn)接入盛有30ml培養(yǎng)液的100ml三角瓶，20℃恒溫振蕩培養(yǎng)12h后備用。</p><p><b>　　2.2.2毒性測(cè)定</b></p><p>　　發(fā)光菌屬革蘭氏陰性、兼性厭氧菌，為非致病菌，寬約0.4—1.0μm，長(zhǎng)約1.0—2.5μm。無(wú)孢子、莢膜，有端生鞭毛一根或數(shù)根，營(yíng)養(yǎng)條件要求不高，最適溫度為15—25℃，最適生長(zhǎng)pH 6.0—9.0，常用

51、于生物毒性測(cè)試的海洋發(fā)光菌，其生長(zhǎng)介質(zhì)中含3％的NaCl和0.3％的甘油對(duì)發(fā)光反應(yīng)很有利。發(fā)光菌在適宜條件下發(fā)光很強(qiáng)，在正常條件下經(jīng)培養(yǎng)后能發(fā)出肉眼可見(jiàn)的藍(lán)綠色熒光，光譜范圍約420—670nm，發(fā)光菌的生長(zhǎng)過(guò)程包括生長(zhǎng)初期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，穩(wěn)定期和衰減期。已有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞合成的“自誘導(dǎo)物”(autoinducer)在對(duì)數(shù)中期大量積累，因此導(dǎo)致發(fā)光迅速增強(qiáng)[32]，所以一般實(shí)驗(yàn)選擇此時(shí)期進(jìn)行毒物測(cè)試。</p><p&

52、gt;　　發(fā)光反應(yīng)是減少的還原型黃素單核苷酸(FMNH2)，分子氧(O2)和一長(zhǎng)鏈的醛發(fā)生催化還原反應(yīng)，并伴隨光的釋放，其發(fā)光反應(yīng)途徑可簡(jiǎn)單概述為[33]：</p><p>　　FMNH2(黃素單核苷酸)+O2(分子氧)+RCHO(長(zhǎng)鏈醛) FMN(黃素單核苷酸)+RCOOH+H2O+光</p><p>　　由于這個(gè)過(guò)程與微生物代謝過(guò)程有關(guān)，因此能夠顯示有毒物質(zhì)對(duì)生物體的毒性作用[34]。

53、即當(dāng)發(fā)光細(xì)菌接觸到環(huán)境中有毒污染物時(shí)，可影響或干擾細(xì)菌的新陳代謝，從而使細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度下降或熄滅，這種發(fā)光強(qiáng)度的變化可以用測(cè)光儀定量地測(cè)定出來(lái)。且發(fā)光強(qiáng)度與毒性大小呈線性關(guān)系，因此可根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度來(lái)判斷有毒化學(xué)物質(zhì)毒性的大小，有毒物質(zhì)的種類(lèi)越多，濃度越大，抑制發(fā)光的能力也越強(qiáng)。影響用相對(duì)抑制率表示：</p><p><b>　　1）單一毒性測(cè)定</b></p><p>

54、　　毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)溫度20℃條件操作。吸取培養(yǎng)好的菌液1mL于50mL 3%NaCl溶液中，于22±1°C環(huán)境下磁力攪拌30min后備用。稱(chēng)取一定量的待測(cè)化合物，用3%NaCl配成儲(chǔ)備液，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定適當(dāng)?shù)臐舛确秶?發(fā)光抑制率在50%上下均有分布)。具體做法是假定母液的濃度為a，預(yù)試驗(yàn)的濃度范圍為0.1a，0.01a，0.001a。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，找出發(fā)光抑制率在50%上下時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度范圍，再按等對(duì)數(shù)間距設(shè)

55、置5個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行，各吸取2mL溶液于發(fā)光管中，用2mL 3%NaCl作空白對(duì)照，迅速吸取0.5mL稀釋菌液于各發(fā)光管中，上下振搖5次，15min后用生物毒性測(cè)試儀(BHP9511，Beijing Binsong Photonics Technology Company)測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。</p><p><b>　　聯(lián)合毒性測(cè)定</b></p><p>

56、;　　將各重金屬配成EC50的濃度，再按1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1、4:1的體積比兩兩混合，組成不同配比的混合體系。測(cè)定各混合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性EC50的實(shí)驗(yàn)步驟與單一毒性的實(shí)驗(yàn)步驟相同。</p><p><b>　　2.3 計(jì)算方法</b></p><p>　　采用毒性單位法（Toxic Unit，M）與指數(shù)</p><

57、p><b>　　1）毒性單位法</b></p><p>　　Sprague和Ramsay規(guī)定：</p><p><b>　　錯(cuò)誤!未指定書(shū)簽。</b></p><p>　　Ci—i組分在混合物中的濃度；</p><p>　　LC50,i—i組分的單一LC50值；</p><

58、p>　　TUi,max—混合物中毒性單位最大值。</p><p>　　根據(jù)M和M0值可以判斷混合物的聯(lián)合作用類(lèi)型，具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表2.3：</p><p>　　表2.3毒性單位法評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)</p><p>　　2）相加指數(shù)法(Additive Index，AI)</p><p>　　相加指數(shù)法是在毒性單位概念基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。1977年M

59、arking將AI定義如下：</p><p>　　M≤1時(shí)，AI=1/M-1； </p><p>　　M>1時(shí)，AI=1-M</p><p>　　AI的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是：當(dāng)AI=0時(shí)，為簡(jiǎn)單的相加作用；當(dāng)AI<0時(shí)，為拮抗作用；當(dāng)AI>0時(shí)，為協(xié)同作用。這種方法在研究多組分混合物的聯(lián)合作用時(shí)應(yīng)用較多，是目前最為常見(jiàn)的混合物聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法。</p&

60、gt;<p><b>　　2.4 實(shí)驗(yàn)流程</b></p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 單一毒性的測(cè)定</p><p>　　根據(jù)2.2.2中實(shí)驗(yàn)步驟本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了Co、Cu、Ba、Ni這四種重金屬類(lèi)化合物對(duì)發(fā)光菌的單一毒性。結(jié)果如表3.1所示。從摩爾濃度上看，六水合

61、硝酸鈷的單一毒性最強(qiáng)(EC50=5.33E-6 mol/L)，其次是硝酸銅(EC50=1.42E-4 mol/L)，而后是硝酸鋇(EC50=0.213 mol/L)，最后是硫酸鎳(EC50=0.837 mol/L)。這一結(jié)果表明，上述四種重金屬類(lèi)化合物對(duì)發(fā)光菌的單一毒性大小關(guān)系為Co>Cu>Ba>Ni。</p><p>　　表3.1 各重金屬化合物對(duì)發(fā)光菌的EC50</p><

62、;p>　　3.2 聯(lián)合毒性測(cè)定</p><p>　　在上述單一毒性的基礎(chǔ)上，將各重金屬配成EC50的濃度，再按1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1、4:1的體積比兩兩混合，組成不同配比的混合體系。測(cè)定各混合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性EC50，結(jié)果如下：</p><p>　　硫酸鎳與硝酸銅的聯(lián)合毒性</p><p><b>　　結(jié)果見(jiàn)表4.1。&

63、lt;/b></p><p>　　表4.1 Ni與Cu的聯(lián)合毒性</p><p>　　由上表可知，硫酸鎳與硝酸銅按1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1、4:1的體積比混合組成的混合體系的M在0.93-0.99的范圍內(nèi)，對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性的相加指數(shù)AI值在0.12-0.70的范圍內(nèi)，可以認(rèn)為其聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用。</p><p>　　硫酸鎳與六

64、水合硝酸鈷的聯(lián)合毒性</p><p><b>　　結(jié)果見(jiàn)表4.2。</b></p><p>　　表4.2 Ni與Co的聯(lián)合毒性</p><p>　　由上表可知，硫酸鎳與六水合硝酸鈷按1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1、4:1的體積比混合組成的混合體系的M在1.16-1.25的范圍內(nèi)，都大于1，對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性的相加指數(shù)AI值在-0

65、.25--0.16的范圍內(nèi)，都大于-1小于0，評(píng)價(jià)結(jié)果為拮抗作用，但其值較理想中的相加作用(AI=0，M=1)也較為接近，則可以認(rèn)為硫酸鎳與六水合硝酸鈷組成的混合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用的弱拮抗作用。</p><p>　　硝酸銅與六水合硝酸鈷的聯(lián)合毒性</p><p><b>　　結(jié)果見(jiàn)表4.3。</b></p><p>　　表

66、4.3 Cu與Co的聯(lián)合毒性</p><p>　　由上表可知，硝酸銅與六水合硝酸鈷按1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1、4:1的體積比混合組成的混合體系在硝酸銅:六水合硝酸鈷體積比為1:2、1:3、1:4時(shí)M在1.00-1.24的范圍內(nèi)，都大于1，對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性的相加指數(shù)AI值在-0.24--0.05的范圍內(nèi)，都大于-1小于0，評(píng)價(jià)結(jié)果為拮抗作用，但其值較理想中的相加作用(AI=0，M=1)也較為

67、接近，則可以認(rèn)為硝酸銅與六水合硝酸鈷組成的混合體系在硝酸銅:六水合硝酸鈷體積比為1:2、1:3、1:4時(shí)對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用的弱拮抗作用；而在硝酸銅:六水合硝酸鈷體積比為1:1、2:1、3:1、4:1時(shí)M在0.77-0.98的范圍內(nèi)，其值都大于0小于1，對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性的相加指數(shù)AI值在0.02--0.30的范圍內(nèi)，其值都大于0小于1，則可以認(rèn)為硝酸銅與六水合硝酸鈷組成的混合體系在硝酸銅:六水合硝酸鈷體積比為1:1、2

68、:1、3:1、4:1時(shí)對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用的弱協(xié)同作用。</p><p>　　硝酸銅與硝酸鋇的聯(lián)合毒性</p><p><b>　　結(jié)果見(jiàn)表4.4。</b></p><p>　　表4.4 Cu與Ba的聯(lián)合毒性</p><p>　　由上表可知，硝酸銅與硝酸鋇按1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1、

69、4:1的體積比混合組成的混合體系M在0.64-0.97的范圍內(nèi)，都小于1，對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性的相加指數(shù)AI值在0.02-0.55的范圍內(nèi)，都大于1小于2，則可以認(rèn)為硝酸銅與硝酸鋇組成的混合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用的弱協(xié)同作用。</p><p>　　硝酸鋇與六水合硝酸鈷的聯(lián)合毒性</p><p><b>　　結(jié)果見(jiàn)表4.5。</b></p>

70、<p>　　由下表可知，硝酸鋇與六水合硝酸鈷按1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1、4:1的體積比混合組成的混合體系在硝酸鋇:六水合硝酸鈷體積比為1:2、1:3、1:4時(shí)M在0.93-1.00的范圍內(nèi)，都小于1，對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性的相加指數(shù)AI值在0.00-0.07的范圍內(nèi)，都大于0小于1，則可以認(rèn)為硝酸鋇與六水合硝酸鈷組成的混合體系在硝酸鋇:六水合硝酸鈷體積比為1:2、1:3、1:4時(shí)對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性</

71、p><p>　　表4.5 Ba與Co的聯(lián)合毒性</p><p>　　表現(xiàn)為近于相加作用的弱協(xié)同作用；而在硝酸鋇:六水合硝酸鈷體積比為1:1、2:1、3:1、4:1時(shí)M在1.02-1.18的范圍內(nèi)，其值都大于1小于2，對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性的相加指數(shù)AI值在-0.18--0.02的范圍內(nèi)，其值都大于-1小于0，則可以認(rèn)為硝酸鋇與六水合硝酸鈷組成的混合體系在硝酸鋇:六水合硝酸鈷體積比為1:1、2:1、

72、3:1、4:1時(shí)對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用的弱拮抗作用。</p><p><b>　　3.3 小結(jié)</b></p><p>　　在25℃條件下，準(zhǔn)確測(cè)定了毒性數(shù)據(jù)，求得其單一毒性的EC50值，并測(cè)定了其兩兩混合對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性。</p><p>　　1) 從摩爾濃度上看，六水合硝酸鈷的單一毒性最強(qiáng)(EC50=5.33E-6 mol/

73、L)，其次是硝酸銅(EC50=1.42E-4 mol/L)，而后是硝酸鋇(EC50=0.213 mol/L)，最后是硫酸鎳(EC50=0.837 mol/L)。這一結(jié)果表明，上述四種重金屬類(lèi)化合物對(duì)發(fā)光菌的單一毒性大小關(guān)系為Co>Cu>Ba>Ni</p><p>　　2) 硫酸鎳與硝酸銅組成的混合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用；硫酸鎳與六水合硝酸鈷組成的混合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為

74、近于相加作用的弱拮抗作用；硝酸銅與六水合硝酸鈷組成的混合體系在硝酸銅:六水合硝酸鈷體積比為1:2、1:3、1:4時(shí)對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用的弱拮抗作用，在硝酸銅:六水合硝酸鈷體積比為1:1、2:1、3:1、4:1時(shí)對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用的弱協(xié)同作用；硝酸銅與硝酸鋇組成的混合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用的弱協(xié)同作用；硝酸鋇與六水合硝酸鈷組成的混合體系在硝酸鋇:六水合硝酸鈷體積比為1:2、1:3、1:4

75、時(shí)對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用的弱協(xié)同作用，在硝酸鋇:六水合硝酸鈷體積比為1:1、2:1、3:1、4:1時(shí)對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為近于相加作用的弱拮抗作用。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　1）成功培養(yǎng)出了發(fā)光強(qiáng)度良好的明亮發(fā)光桿菌T3，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了良好的實(shí)驗(yàn)素材。</p><p>　　2）通過(guò)實(shí)

76、驗(yàn)得到了Co、Cu、Ba、Ni的單一毒性EC50值，以及它們兩兩混合的聯(lián)合毒性的大小，并采用毒性單位法和指數(shù)相加法分析了其聯(lián)合作用的類(lèi)型。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 林志芬, 孔德洋, 殷克東, 等. 腈醛混合化合物對(duì)發(fā)光菌聯(lián)合毒性的QSAR研究[J]. 環(huán)境化學(xué), 2005, 24(3): 296-301.</p

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