納米tio2對(duì)斑馬魚肝損傷基因表達(dá)的影響【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　納米TiO2對(duì)斑馬魚肝損傷基因表達(dá)的影響</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí)

2、 生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b&

3、gt;</p><p><b>　　1 引言2</b></p><p><b>　　2 材料與方法3</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料3</p><p>　　2.1.1 動(dòng)物材料1</p><p>　　2.1.2 主要試劑1</p><

4、;p>　　2.1.3 主要設(shè)備3</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法3</p><p>　　2.2.1 斑馬魚的馴養(yǎng)3</p><p>　　2.2.2 斑馬魚的染毒處理4</p><p>　　2.2.3 斑馬魚總RNA的提取4</p><p>　　2.2.3.1 使用Biozol試劑提取RNA4&l

5、t;/p><p>　　2.2.3.2 總RNA完整性檢測(cè)4</p><p>　　2.2.3.3 總RNA濃度及純度分析4</p><p>　　2.2.4 RT-PCR擴(kuò)增4</p><p>　　2.2.4.1 RT-PCR反應(yīng)體系4</p><p>　　2.2.4.2 PCR反應(yīng)條件5</p>&l

6、t;p>　　2.2.4.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)6</p><p>　　2.3 數(shù)據(jù)處理6</p><p><b>　　3 結(jié)果6</b></p><p>　　3.1 斑馬魚肝總RNA完整性檢測(cè)6</p><p>　　3.2 總RNA的濃度及純度檢測(cè)7</p><p>　　3.3 納米Ti

7、O2對(duì)各基因表達(dá)的影響7</p><p>　　3.3.1 納米TiO2對(duì)ACTIN基因表達(dá)的影響7</p><p>　　3.3.2 納米TiO2對(duì)CTR1基因表達(dá)的影響8</p><p>　　3.3.3 納米TiO2對(duì)MTF-1基因表達(dá)的影響9</p><p>　　3.3.4 納米TiO2對(duì)NKA基因表達(dá)的影響10</p>

8、;<p>　　3.3.5 納米TiO2對(duì)HSP70基因表達(dá)的影響11</p><p>　　3.3.6 納米TiO2對(duì)HIF基因表達(dá)的影響12</p><p>　　4 分析與展望13</p><p>　　4.1 納米TiO2對(duì)斑馬魚肝CTR1基因表達(dá)影響的機(jī)理分析13</p><p>　　4.2 納米TiO2對(duì)斑馬魚肝MT

9、F-1基因表達(dá)影響的機(jī)理分析13</p><p>　　4.3 納米TiO2對(duì)斑馬魚肝NKA基因表達(dá)影響的機(jī)理分析14</p><p>　　4.4 納米TiO2對(duì)斑馬魚肝HSP70基因表達(dá)影響的機(jī)理分析14</p><p>　　4.4 納米TiO2對(duì)斑馬魚肝HIF基因表達(dá)影響的機(jī)理分析15</p><p><b>　　4.5

10、展望15</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)16</b></p><p>　　摘要：為探討納米TiO2（Nano-TiO2）顆粒對(duì)斑馬魚（Danio rerio）肝損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響，選取濃度為5.6mgL-1的 TiO2培養(yǎng)斑馬魚，運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)分析相關(guān)基因在不同處理時(shí)間（6h，12h，24h，48h，72h）的表達(dá)量。共檢

11、測(cè)了HSP70（heat shock protein，熱休克蛋白）、HIF (hypoxia inducible factor，低氧誘導(dǎo)因子)、CTR1（copper transporter 1，銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、MTF-1（metal-responsive transcription factor-1，金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子）、NKA（Na+-K+-ATPase，鈉鉀ATP酶）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納米Ti02對(duì)CTR1基因的表達(dá)影響不顯著，而對(duì)

12、其他相關(guān)基因表達(dá)有著較明顯的影響，并且對(duì)不同基因的表達(dá)的影響呈多樣性。本研究旨為深入研究魚類基因表達(dá)與重金屬解毒分子機(jī)制間的關(guān)系，以及為研究納米材料毒理奠定基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞： 納米TiO2；肝損傷；基因表達(dá)</p><p>　　Abstract: To investigate the expression of zebra fish (Danio rerio) gene

13、related to liver injury under the influence of Nano-TiO2 particles. Using Nano-TiO2 particles with concentration of 5.6mg·L-1 to feed zebra fish and Using Semi-quantitative RT-PCR technology to analysis the expressi

14、on of associated genes in different time (6h, 12, 24h, 48h, 72h). In total, HSP70 (heat shock protein), HIF (hypoxia inducible factor), CTR1 (copper transporter 1), MTF-1(metal-responsive transcription factor-1) </p&g

15、t;<p>　　Keywords: Nano-TiO2; liver injury; gene expression1 引言</p><p>　　納米是英文namometer的譯音，是一個(gè)物理學(xué)上的度量單位，1納米是1米的十億分之一，相當(dāng)于45個(gè)原子排列起來(lái)的長(zhǎng)度。當(dāng)物質(zhì)到達(dá)納米尺度以后，大約是在1～100納米這個(gè)范圍內(nèi)，物質(zhì)的性能就會(huì)發(fā)生突變，出現(xiàn)特殊性能。這種具不同于原來(lái)組成的原子、分子，也不同

16、于宏觀的物質(zhì)的特殊性能所構(gòu)成的材料，即為納米材料[1]。</p><p>　　納米TiO2（Nano-TiO2，簡(jiǎn)稱n-TiO2）作為應(yīng)用廣泛的納米材料之一，其應(yīng)用范圍從民眾日用品牙膏，防曬霜到工業(yè)品如油漆、涂料、傳感器以及污水處理等眾多領(lǐng)域[2]。納米TiO2的加入，對(duì)原物質(zhì)的理化性質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生很大的影響[3]，所以，隨著對(duì)納米材料研究的深入，應(yīng)用范圍在不斷拓寬，對(duì)人類的影響也在日益擴(kuò)大。</p>

17、<p>　　隨著納米TiO2被不斷的應(yīng)用于相關(guān)產(chǎn)業(yè)，其對(duì)人類造成的危害也凸顯了出來(lái)。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，納米TiO2對(duì)生物肺上皮細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性影響是比較嚴(yán)重的，可以導(dǎo)致各種心血管與呼吸道疾病[4]。</p><p>　　斑馬魚（Danio rerio）又名藍(lán)條魚、花條魚、斑馬擔(dān)尼魚，是一種熱帶觀賞魚，屬鯉科短擔(dān)尼爾屬。原產(chǎn)于印度、孟加拉國(guó)[5]。斑馬魚容易獲得，易于飼養(yǎng)，生殖周期短，繁殖能力強(qiáng)，結(jié)構(gòu)

18、簡(jiǎn)單，基因組和其它許多方面都與人類有著極大的相似性。斑馬魚的特點(diǎn)使其在20世紀(jì)70年代開(kāi)始受到科學(xué)家們的關(guān)注，并成為最重要的模式脊椎動(dòng)物之一[6]。</p><p>　　目前對(duì)生物體內(nèi)組織損傷相關(guān)基因的研究取得了很大的進(jìn)展。如HSP70（heat shock protein 70，熱休克蛋白70），它是一組廣泛存在于微生物和動(dòng)植物體內(nèi)的生物進(jìn)化中高度保守的多肽蛋白。由于此類蛋白的合成與熱休克反應(yīng)有關(guān)，所以命名為熱

19、休克蛋白（heat shock protein）。除高熱之外，多種應(yīng)激原如重金屬、饑餓、缺氧缺血等都可以誘導(dǎo)HSP的表達(dá)[7]。</p><p>　　HIF (hypoxia inducible factor，低氧誘導(dǎo)因子)，是一種分布和作用十分廣泛的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，可以被多種胞外刺激活化、上調(diào)影響細(xì)胞存活、生長(zhǎng)分化以及凋亡的基因表達(dá)，具有重要的生理和病理作用。今年來(lái)，由于人為地向水體中排放過(guò)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有機(jī)

20、物質(zhì)，水體富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，導(dǎo)致缺氧現(xiàn)象頻繁發(fā)生。HIF作為低氧相關(guān)基因調(diào)控中重要的核心轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)成為相關(guān)研究中的重點(diǎn)[8]。</p><p>　　CTR1（copper transporter 1，銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），CTR1蛋白是銅離子攝入蛋白，是銅進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵運(yùn)輸工具，其表達(dá)量的多少直接關(guān)系到機(jī)體銅代謝的平衡[9]。相關(guān)研究表明，CTR1可能與機(jī)體其他金屬代謝平衡有一定關(guān)系[10]。</p>&

21、lt;p>　　此外，MTF-1（metal-responsive transcription factor-1，金屬反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子）和NKA（Na+-K+-ATPase，鈉鉀ATP酶）都是細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白，在細(xì)胞損傷調(diào)控機(jī)制中有著很重要的地位[11]。</p><p>　　盡管對(duì)魚類，人類腫瘤細(xì)胞中的相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控已經(jīng)有了深入的研究，證明了相關(guān)基因的重要作用及調(diào)控過(guò)程[12]。但是對(duì)于納米材料對(duì)生物組織

22、損傷相關(guān)基因表達(dá)的報(bào)道尚不多。斑馬魚作為一種重要的模式生物，研究納米TiO2對(duì)其肝損傷相關(guān)基因的表達(dá)是有非常重要的意義的。本實(shí)驗(yàn)以藍(lán)色斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)材料，采用one-step RT-PCR技術(shù)檢測(cè)斑馬魚肝損傷相關(guān)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不僅可以為斑馬魚肝損傷相關(guān)基因表達(dá)的分子機(jī)制提供參考，還可以為納米材料對(duì)生物的傷害研究提供一定的依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)際意義。</p><p><b>　　2 材料與方

23、法 </b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1 動(dòng)物材料</p><p>　　斑馬魚（Danio rerio），購(gòu)自寧波天勝花鳥市場(chǎng)，體型大小相似，長(zhǎng)約3.5cm，健康，活力正常。</p><p>　　2.1.2 主要試劑</p><p&

24、gt;　　納米TiO2：購(gòu)于杭州大洋納米新材料有限公司；</p><p>　　Bizol RNA提取試劑盒：購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；</p><p><b>　　異丙醇；</b></p><p><b>　　氯仿（三氯甲烷）；</b></p><p><b>　　75%乙醇；

25、</b></p><p>　　TaKaRa PrimeScript@ One Step RT-PCR Kit Ver.2: 購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；</p><p>　　Ribonuclease Inhibitor（核糖核酸酶抑制劑）；</p><p><b>　　DEPC-H2O；</b></p><p

26、>　　KMnO4（高錳酸鉀）；</p><p>　　DNA Marker，6×Loading Buffer：購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。</p><p>　　2.1.3 主要設(shè)備</p><p>　　SW-CJ-3FD型雙人單面凈化工作臺(tái)；</p><p>　　裝備控溫裝置及充氣的魚缸；</p><p&

27、gt;　　NEOFUGE-15R型高速冷凍離心機(jī)；</p><p>　　AB104-N型電子分析天平；</p><p><b>　　超聲波振蕩儀；</b></p><p>　　JunYi 600+雙控電泳儀；</p><p>　　PX2 Thermal Cycler PCR自動(dòng)分析儀；</p><p&

28、gt;<b>　　液氮罐；</b></p><p>　　Alpha Imager 2200凝膠圖像處理系統(tǒng)；</p><p>　　Thermo nanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 斑馬魚的馴養(yǎng)</p

29、><p>　　將購(gòu)買來(lái)的斑馬魚在去氯離子水中馴養(yǎng)。調(diào)節(jié)魚缸內(nèi)溫度為28℃左右，于每天09:00和17:00按斑馬魚體重的5%-10%的量投放飼料。調(diào)節(jié)投放飼料量以使斑馬魚健康的生長(zhǎng)。2-3天換水一次，每次大約換去缸內(nèi)2/3的水。每天觀察并作記錄，檢查缸內(nèi)溫度及充氣裝備是否正常，清潔魚缸。</p><p>　　2.2.2 斑馬魚的染毒處理</p><p>　　馴養(yǎng)兩周后，

30、取25尾大小相似，身體健壯的斑馬魚，投放于放有20L去氯離子水的魚缸中飼養(yǎng)。稱取0.112g的納米TiO2顆粒，放于燒杯中。用200ml的去氯離子水溶解，置于超聲波振蕩儀中振蕩約30min后觀察。若TiO2顆粒均勻的分散于溶液中，溶液顏色均勻，燒杯底部無(wú)沉淀。將溶液倒入魚缸中，對(duì)斑馬魚進(jìn)行染毒處理。染毒時(shí)間持續(xù)72h，在第6h，12h，24h，48h，72h各取5尾魚，提取斑馬魚肝放入液氮中凍存，備用。</p><p

31、>　　2.2.3 斑馬魚總RNA的提取</p><p>　　2.2.3.1 使用Biozol試劑提取RNA</p><p>　　按照試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行操作：</p><p>　　將提取的肝組織在已用液氮預(yù)冷的研缽中研磨，直至組織被研磨至粉末。將1ml的Bizol加入研缽中進(jìn)行裂解。</p><p>　　將裂解液靜置約30min，待裂解

32、液完全溶化后，用RNA專用槍頭吸入EP管中，在室溫下放置15-20min。</p><p>　　加入200ul的氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩混勻30s。再于冰上孵育15min。臺(tái)式高度冷凍離心機(jī)上，于4℃，12000r/min條件下離心15min。RNA存在于離心后混合物的上清層中。將上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，加入等體積冰浴的異丙醇，緩慢混勻，用以沉淀RNA。</p><p>　　將樣

33、品在-20℃條件下孵育20min以上。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)上，以4℃，12000r/min條件離心10min。RNA沉淀膠狀形成于管底或者管壁上。</p><p>　　小心棄去上清液，防止RNA沉淀丟失。用冰浴的75%的乙醇洗滌兩次，顛倒洗滌管壁，漩渦振蕩樣品。使RNA沉淀懸浮。4℃，12000r/min下離心5min，小心棄去上清液，防止RNA沉淀丟失。晾干RNA沉淀。</p><p>　

34、　用50ul DEPC-H2O溶解沉淀，并加入0.5ul的RNA酶抑制劑。放于-40℃冰箱保存。</p><p>　　2.2.3.2 總RNA完整性檢測(cè)</p><p>　　采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性。取5ul已處理好的總RNA樣品，于1%瓊脂糖凝膠中，電泳20min左右，使用凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察條帶。</p><p>　　如果觀察到電泳后的瓊脂糖凝膠上有

35、三條帶：28S rRNA、18S rRNA和5.8S rRNA。28S rRNA與18S rRNA條帶明亮，5.8S rRNA條帶較弱。且，28S rRNA的亮度約為18S rRNA的兩倍，則提取出的總RNA的完整性是比較好的。</p><p>　　2.2.3.3 總RNA濃度及純度分析</p><p>　　為了保證提取到的RNA的純度，使用Thermo nanoDrop 1000超微量分

36、光光度計(jì)對(duì)RNA進(jìn)行濃度測(cè)量和純度檢測(cè)。核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm，蛋白質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)為280nm，鹽和小分子為230nm。質(zhì)量較好的RNA，其OD260/OD280應(yīng)該在1.7-2.0之間。小于1.7說(shuō)明有蛋白質(zhì)或酚的存在；大于2.0則說(shuō)明有異硫氰酸的存在。其OD263/OD230應(yīng)該在2-2.5之間。如果較低則說(shuō)明有鹽的存在。根據(jù)以上數(shù)據(jù)分析提取到的總RNA純度。</p><p>　　2.2.4 RT-P

37、CR 擴(kuò)增</p><p>　　2.2.4.1 RT-PCR反應(yīng)體系</p><p>　　表1 PCR反應(yīng)體系</p><p>　　Tab.1 Reaction system of PCR</p><p>　　參照寶生物工程（大連）有限公司PrimeScript@ One Step RT-PCR Kit Ver.2使用說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)總體積

38、為25ul。</p><p>　　2.2.4.2 PCR反應(yīng)條件</p><p>　　表2 ACTIN基因的PCR反應(yīng)條件</p><p>　　Tab.2 PCR Reaction conditions of ACTIN gene</p><p>　　表3 MTF-1基因的PCR反應(yīng)條件</p><p>　　Tab.3

39、 PCR Reaction conditions of MTF-1 gene</p><p>　　表4 HIF基因的PCR反應(yīng)條件</p><p>　　Tab.4 PCR Reaction conditions of HIF gene</p><p>　　表5 NKA基因的PCR反應(yīng)條件</p><p>　　Tab.5 PCR Reactio

40、n conditions of NKA gene</p><p>　　表6 CTR1基因的PCR反應(yīng)條件</p><p>　　Tab.6 PCR Reaction conditions of CTR1 gene</p><p>　　表7 HSP70基因的PCR反應(yīng)條件</p><p>　　Tab.7 PCR Reaction conditio

41、ns of HSP70 gene</p><p>　　2.2.4.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)</p><p>　　擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。采用瓊脂糖凝膠電泳法，使用凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察條帶。</p><p><b>　　2.3 數(shù)據(jù)處理</b></p><p>　　使用Excel軟件和SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，使用Quan

42、tity One軟件進(jìn)行電泳之后的信息處理。將內(nèi)參基因actin的信息量設(shè)為100，計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量，并結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行分析。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 斑馬魚肝總RNA完整性檢測(cè)</p><p>　　所提取的斑馬魚肝組織總RNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，看到清晰的28S rRNA與18

43、S rRNA條帶，表明所提取的總RNA完整性較好（圖1）。同時(shí)，泳道無(wú)殘留物，說(shuō)明提取的RNA里基本無(wú)DNA殘留。以上結(jié)果說(shuō)明，所提取的肝組織RNA可以供下步實(shí)驗(yàn)使用。</p><p>　　圖1 斑馬魚肝組織總RNA電泳圖</p><p>　　Fig.1 Electrophoresis pattern of total RNA of the liver of Danio rerio<

44、/p><p>　　3.2 總RNA的濃度及純度檢測(cè)</p><p>　　使用Thermo nanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)對(duì)RNA進(jìn)行濃度測(cè)量和純度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8所示，對(duì)照組及各處理組的OD260/280的值處于1.99到2.04之間，表明所提RNA純度較高，可供下一步實(shí)驗(yàn)使用。</p><p>　　表8 總RNA的濃度及純度</p>&l

45、t;p>　　Tab.8 Concentration and purity of total RNA</p><p>　　3.3 納米TiO2對(duì)各基因表達(dá)的影響</p><p>　　3.3.1 納米TiO2對(duì)ACTIN基因表達(dá)的影響</p><p>　　看家基因又稱管家基因，是所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類基因。其表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小。斑馬魚ACTIN基因（肌動(dòng)

46、蛋白基因）是典型的看家基因，以斑馬魚ACTIN基因作為內(nèi)參來(lái)消除相關(guān)基因表達(dá)由原始RNA濃度不同所帶來(lái)的誤差。將在不同時(shí)間處理后提取的RNA稀釋到相同濃度（100ng·μL-1），用于基因檢測(cè)。圖2為將斑馬魚暴露培養(yǎng)在5.6 mg·L-1納米TiO2 ACTIN基因的表達(dá)情況。如圖2所示，ACTIN在不同的處理組表達(dá)量一致，為測(cè)量相關(guān)基因的表達(dá)情況提供了準(zhǔn)確的依據(jù)。</p><p>　　圖2

47、ACTIN基因在不同時(shí)間的表達(dá)量</p><p>　　Fig.2 Expression of ACTIN gene in different time</p><p>　　3.3.2 納米TiO2對(duì)CTR1基因表達(dá)的影響</p><p>　　將斑馬魚暴露培養(yǎng)在在5.6 mg·L-1納米TiO2中所提取到的肝組織CTR1基因表達(dá)情況隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CTR

48、1基因的表達(dá)與對(duì)照組比無(wú)顯著變化（圖3）。如圖4所示，在整個(gè)處理期間，CTR1的基因表達(dá)量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著變化（P>0.05）。</p><p>　　圖3 CTR1基因與在不同時(shí)間的表達(dá)量</p><p>　　Fig.3 Expression of CTR1 in different time</p><p>　　注：左起為maker標(biāo)記；1-對(duì)照組；2-

49、處理6h肝；</p><p>　　3-處理12h肝；4-處理24h肝；5-處理48h肝；6-處理72h肝</p><p>　　圖4 納米TiO2對(duì)CTR1基因表達(dá)的影響</p><p>　　Fig.4 The expression of CTR1 gene under the influence of Nano-TiO2</p><p>　　

50、3.3.3 納米TiO2對(duì)MTF-1基因表達(dá)的影響</p><p>　　經(jīng)納米TiO2處理不同時(shí)間MTF-1基因的表達(dá)情況見(jiàn)圖5,6h條帶的亮度要明顯高于對(duì)照組，在之后的處理時(shí)間中，條帶整體呈下降趨勢(shì)。如圖6所示，在使用納米TiO2處理6h后，MTF-1基因的表達(dá)量相比對(duì)照組有較顯著的上升，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到78.84。在之后的處理時(shí)間中，MTF-1基因的相對(duì)表達(dá)量總體呈下降趨勢(shì)。除了48h處理組外，各處理組均與對(duì)照

51、組有顯著差異（P>0.05）。</p><p>　　圖5 MTF-1基因在不同時(shí)間的表達(dá)量</p><p>　　Fig.5 Expression of MTF-1 in different time</p><p>　　注：最右為maker標(biāo)記；1-對(duì)照組；2-處理6h肝；</p><p>　　3-處理12h肝；4-處理24h肝；5-處

52、理48h肝；6-處理72h肝</p><p>　　圖6納米TiO2對(duì)MTF-1基因表達(dá)的影響</p><p>　　Fig.6The expression of MTF-1 gene under the influence of Nano-TiO2</p><p>　　3.3.4 納米TiO2對(duì)NKA基因表達(dá)的影響</p><p>　　NKA基

53、因在不同處理時(shí)間的表達(dá)量如圖7所示。除處理24h組外，其余處理組均與對(duì)照組有顯著差異（P<0.05）。處理6h后，NKA的表達(dá)量有一定增加，12h表達(dá)量有下降至最低值，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到22.75。在之后的處理時(shí)間表達(dá)量上升， 48h達(dá)到最大值；72h表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降（圖8）。</p><p>　　圖7 NKA基因在不同處理時(shí)間的表達(dá)量</p><p>　　Fig.7 Expressi

54、on of NKA in different time</p><p>　　注：左起為maker標(biāo)記；1-對(duì)照組；2-處理6h肝；</p><p>　　3-處理12h肝；4-處理24h肝；5-處理48h肝；6-處理72h肝</p><p>　　圖8納米TiO2對(duì)NKA基因表達(dá)的影響</p><p>　　Fig.8 The expression

55、 of NKA gene under the influence of Nano-TiO2</p><p>　　3.3.5 納米TiO2對(duì)HSP70基因表達(dá)的影響</p><p>　　經(jīng)納米TiO2處理后，，各組的HSP70基因表達(dá)量如圖9。與對(duì)照組相比，各處理組的HSP70表達(dá)量均有顯著差異（P<0.05）。6h處理組相對(duì)表達(dá)量有顯著上升；在12h處相對(duì)表達(dá)量降至最低，為20.33

56、，在之后的處理時(shí)間中表達(dá)量逐漸上升（圖10）。</p><p>　　圖9 HSP70基因在不同處理時(shí)間的表達(dá)量</p><p>　　Fig.9 Expression of HSP70 in different time</p><p>　　注：左起為maker標(biāo)記；1-對(duì)照組；2-處理6h肝；</p><p>　　3-處理12h肝；4-處理2

57、4h肝；5-處理48h肝；6-處理72h肝</p><p>　　圖10 納米TiO2對(duì)HSP70基因表達(dá)的影響</p><p>　　Fig.10 The expression of HSP70 gene under the influence of Nano-TiO2</p><p>　　3.3.6納米TiO2對(duì)HIF基因表達(dá)的影響</p><p

58、>　　如圖11所示，加入納米TiO2后HIF基因的表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的變化。各處理組與對(duì)照組之間均有顯著差異（P<0.05）。在6h HIF基因的表達(dá)量相對(duì)對(duì)照組有明顯的上升；在12h處表達(dá)量下降，但仍高于對(duì)照組，在之后的處理時(shí)間中，HIF基因的表達(dá)量逐漸上升（圖12）。</p><p>　　圖11 HIF基因在不同處理時(shí)間的表達(dá)量</p><p>　　Fig.11 Expres

59、sion of HIF in different time</p><p>　　圖12納米TiO2對(duì)HIF基因表達(dá)的影響</p><p>　　Fig.12 The expression of HIF gene under the influence of Nano-TiO2</p><p><b>　　4 分析與展望</b></p>

60、<p>　　4.1 納米TiO2對(duì)斑馬魚肝CTR1基因表達(dá)影響的機(jī)理分析</p><p>　　CTR1存在于所有物種及機(jī)體的各個(gè)組織中，在肝臟和腎臟的表達(dá)量最高。CTR1是銅進(jìn)入細(xì)胞的大門，其表達(dá)量的多少直接關(guān)系到機(jī)體銅代謝的平衡，是銅在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝的前提條件和重要基礎(chǔ)。CTR1受可利用的銅水平的調(diào)控，銅缺乏可促進(jìn)基因表達(dá)，銅過(guò)量時(shí)抑制表達(dá)。CTR1在細(xì)胞代謝中起著非常重要的作用，當(dāng)機(jī)體內(nèi)缺乏CT

61、R1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)缺銅，表現(xiàn)為一系列銅缺乏狀況[9]。</p><p>　　在其他研究中顯示，銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅參與調(diào)節(jié)體內(nèi)銅的代謝平衡，在某些藥物如化療藥物順鉑的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中也起著重要的作用。于海林[10]等研究鉑類藥物對(duì)人卵巢癌細(xì)胞中CTR1基因的表達(dá)影響發(fā)現(xiàn)，CTR1基因參與了相關(guān)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且其高表達(dá)與外界藥物的濃度有關(guān)。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，C

62、TR1基因的表達(dá)量并無(wú)顯著變化。分析其原因可能為：CTR1基因的表達(dá)對(duì)外界刺激的金屬或者藥物有特異性；處理的濃度不當(dāng)，未能影響CTR1基因的表達(dá)。改變處理濃度及處理時(shí)間可能會(huì)使CTR1基因的表達(dá)發(fā)生變化，有待下一步研究。</p><p>　　4.2 納米TiO2對(duì)斑馬魚肝MTF-1基因表達(dá)影響的機(jī)理分析</p><p>　　在分子生物學(xué)中，轉(zhuǎn)錄因子（Transcription facto

63、r）是指能夠結(jié)合在某基因上游特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能調(diào)控其基因的轉(zhuǎn)錄。金屬反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子為鋅指結(jié)構(gòu)之轉(zhuǎn)錄因子，它能與金屬硫蛋白啟動(dòng)子上的金屬感應(yīng)序列結(jié)合，藉以調(diào)控金屬硫蛋白的表現(xiàn)。</p><p>　　金屬硫蛋白（metallothionein, MT）為富含巰基，能螯合大量的金屬離子的蛋白。MT廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物以及微生物中，其理化性質(zhì)基本一致。隨著人類對(duì)金屬硫蛋白的研究逐漸深入，對(duì)其在重金

64、屬的解毒過(guò)程和參與微量元素代謝中的作用了解日益深入[14]。金屬硫蛋白具有廣泛的生物效應(yīng)，體現(xiàn)在一些金屬代謝引起的遺傳性疾病、重金屬中毒疾病、心血管系統(tǒng)疾病中。</p><p>　　相關(guān)研究表明，重金屬可誘導(dǎo)MT的表達(dá)。Norey[15]等人在注射Cd到虹鱒體內(nèi)誘導(dǎo)MT表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，注射后6到12h，肝中的表達(dá)量急劇上升，在6-12h最高誘導(dǎo)后，肝中的表達(dá)水平開(kāi)始下降，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由于MTF-1表達(dá)與

65、MT表達(dá)具有協(xié)同性，故MT基因表達(dá)情況一定程度上可以代表MTF-1的表達(dá)情況。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納米TiO2影響了MTF-1基因的表達(dá)。在誘導(dǎo)6h后，其表達(dá)量急劇上升。MTF-1作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控MT的表達(dá)，可以將細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的納米材料粒子泵出，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。在6h后MTF-1的表達(dá)量逐漸下降，分析這可能因?yàn)樵?h后，MT代謝加快，細(xì)胞內(nèi)納米材料的濃度降低。隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，納米TiO2與M

66、T結(jié)合的形式和類型也發(fā)生了變化，進(jìn)而導(dǎo)致了MTF-1基因表達(dá)的下降。在納米材料脅迫下，斑馬魚肝中MTF-1基因表達(dá)變化機(jī)理需要我們從相關(guān)酶的活性及更多相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)方向入手研究。</p><p>　　4.3 納米TiO2對(duì)斑馬魚肝NKA基因表達(dá)影響的機(jī)理分析</p><p>　　NKA（Na+-K+-ATPase，鈉鉀ATP酶）實(shí)際上就是鈉鉀泵，一般認(rèn)為是由兩個(gè)大亞基、兩個(gè)小亞基組成的

67、四聚體。其作用是：維持細(xì)胞的滲透性、保持細(xì)胞的體積、維持低Na+高K+的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、維持細(xì)胞的靜息電位[16]。</p><p>　　侯彥峰[16]等人在研究皮質(zhì)醇影響青鮪鰓內(nèi)鈉鉀ATP酶基因表達(dá)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，青鮪鰓內(nèi)NKA基因的表達(dá)在48h被顯著誘導(dǎo)。上述研究成果對(duì)本實(shí)驗(yàn)具有一定的參考意義。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除72h外，對(duì)照組中NKA基因的表達(dá)量與處理組中均有顯著差異（

68、P<0.05），說(shuō)明納米TiO2的加入，影響了NKA基因的表達(dá)。與對(duì)照組相比，處理6h時(shí)，NKA基因的表達(dá)量有一定的增加，可能由于加入納米TiO2后，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓發(fā)生變化，NKA基因表達(dá)編碼鈉鉀ATP酶以維持細(xì)胞的滲透性。在12h時(shí)，NKA的表達(dá)量下降，甚至低于對(duì)照組，說(shuō)明NKA基因的表達(dá)受到了抑制，可能是因?yàn)镹KA基因的表達(dá)調(diào)節(jié)了細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)鈉鉀ATP酶的需求降低，故NKA基因的表達(dá)降低。在12h之后NKA

69、表達(dá)量逐漸上升，在48h達(dá)到最高，隨后在72h表達(dá)量下降。NKA基因的波動(dòng)性表達(dá)可能是由于NKA基因的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的相互作用的原因。</p><p>　　納米TiO2的加入對(duì)NKA基因的表達(dá)造成了影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明NKA基因的表達(dá)與細(xì)胞滲透壓的變化可能是雙向作用的。故NKA基因的表達(dá)呈波動(dòng)狀，可能與NKA基因表達(dá)后造成細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡性的波動(dòng)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)為短期內(nèi)NKA基因的表達(dá)，要更深入的了解

70、NKA基因作用的分子機(jī)制，可能需要延長(zhǎng)處理時(shí)間及改變處理濃度。</p><p>　　4.4 納米TiO2對(duì)斑馬魚肝HSP70基因表達(dá)影響的機(jī)理分析</p><p>　　HSP70（heat shock protein，熱休克蛋白）是進(jìn)化上高度保守的應(yīng)激蛋白，通常認(rèn)為具有分子伴侶的功能，參與修復(fù)和重疊受脅迫傷害的蛋白以及正常蛋白的合成、折疊和運(yùn)輸。其可以賦予細(xì)胞從各種應(yīng)激中恢復(fù)的能力和保護(hù)它

71、們免遭這些應(yīng)激因素的損害 [17]。</p><p>　　在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，重金屬對(duì)HSP70的表達(dá)有著較明顯的影響。在劉迪秋[18]等研究重金屬對(duì)鯽魚肝臟損傷相關(guān)基因表達(dá)影響實(shí)驗(yàn)中[18]，對(duì)HSP70的表達(dá)有著明顯的影響，并且HSP70基因的表達(dá)量在24h處達(dá)到最大值，在之后的處理時(shí)間表達(dá)量下降。</p><p>　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定相似性，由于實(shí)驗(yàn)用魚及處理材料的不同

72、，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)具有一定的差距。</p><p>　　在本實(shí)驗(yàn)中，處理組均與對(duì)照組有顯著差異（P<0.05），說(shuō)明納米TiO2可以影響HSP70的表達(dá)。處理6h組中HSP70的表達(dá)量有顯著上升，可能是因?yàn)镠SP70作為一種分子伴侶，可以幫助變性受損的蛋白質(zhì)復(fù)性或降解,保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，減輕細(xì)胞損傷。在用納米TiO2處理后，HSP70大量表達(dá)以保護(hù)機(jī)體；在12h表達(dá)量出現(xiàn)了顯著的下降，很可能是由于納米Ti

73、O2處理一段時(shí)間后，對(duì)肝細(xì)胞造成了一定的損害，一定數(shù)量的肝細(xì)胞DNA受損發(fā)生凋亡，導(dǎo)致HSP70的表達(dá)量降低[19]。這說(shuō)明HSP70對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用不是無(wú)休止的，其表達(dá)需要付出代價(jià)，超過(guò)一定范圍后HSP70的表達(dá)量將會(huì)下降；12h后HSP70的表達(dá)逐漸上升，這可能由于機(jī)體自身的調(diào)控與恢復(fù)作用，HSP70表達(dá)量恢復(fù)。</p><p>　　4.4 納米TiO2對(duì)斑馬魚肝HIF基因表達(dá)影響的機(jī)理分析</p>

74、;<p>　　HIF (hypoxia inducible factor，低氧誘導(dǎo)因子)是一種異源二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)動(dòng)物為適應(yīng)低氧條件而發(fā)生的基因表達(dá)的改變。在低氧時(shí)，HIF蛋白得以穩(wěn)定，并活化一系列基因如促進(jìn)紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、糖酵解酶等來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞供能供氧能力，促使細(xì)胞在低氧環(huán)境下存活。除低氧外，HIF還能被熱、機(jī)械壓、輻射、化學(xué)試劑等環(huán)境刺激活化 [20]。</p><p>　

75、　近年研究發(fā)現(xiàn)，重金屬離子處理可引起魚鰓上皮細(xì)胞處于低氧狀態(tài)，從而激活HIF進(jìn)行表達(dá)[21]。</p><p>　　加入納米TiO2后6小時(shí)，HIF基因表達(dá)顯著增加，這是由于加入納米材料后造成斑馬魚肝細(xì)胞缺氧，氧減少時(shí)氧感受器激活一種信號(hào)，導(dǎo)致HIF表達(dá)升高，HIF基因大量表達(dá)以增強(qiáng)細(xì)胞供氧能力并維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在12h處表達(dá)量降低可能由于細(xì)胞凋亡，肝細(xì)胞DNA受損，HIF基因表達(dá)受到抑制。之后表達(dá)量穩(wěn)定上升

76、，可能由于肝細(xì)胞數(shù)量及功能的恢復(fù)，HIF表達(dá)以適應(yīng)肝細(xì)胞缺氧環(huán)境。</p><p>　　HIF基因與HSP70基因的表達(dá)情況相似，猜測(cè)它們之間可能有某種協(xié)同作用，由于HSP作為一種分子伴侶蛋白，其能幫助蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定與運(yùn)輸，并能調(diào)控很多種蛋白的活化。近年研究表明，HSP蛋白與HIF之間是雙向調(diào)控的[23]，故HSP70基因的表達(dá)情況與HIF基因的表達(dá)情況相似，符合本研究的結(jié)果。</p><p

77、><b>　　4.5 展望</b></p><p>　　當(dāng)前，納米材料被越來(lái)越多的用于商業(yè)用途，像裝填物、折光劑、半導(dǎo)體、催化劑、化妝品、微電子學(xué)和藥物載體等方面。納米材料的廣泛應(yīng)用可能對(duì)環(huán)境和健康產(chǎn)生正面和負(fù)面的影響。納米材料的新穎性引起人們對(duì)其負(fù)面生物效應(yīng)的關(guān)注。一些研究提出納米材料并不完全是有益的，他們?cè)诩?xì)胞、亞細(xì)胞和蛋白質(zhì)水平上影響著生物學(xué)行為[22]。</p>

78、<p>　　納米材料生產(chǎn)和使用過(guò)程中可以通過(guò)直接接觸進(jìn)入人體，而且還可能以多種方式在環(huán)境中傳播，進(jìn)入大氣、水或者土壤。在納米材料進(jìn)入生物體內(nèi)的危害到底如何衡量，這都是發(fā)展納米科技的同時(shí)需要討論的問(wèn)題。只有對(duì)納米材料的生物效應(yīng)有清楚的了解，才能正確的使用而避免它對(duì)人體產(chǎn)生副作用。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以模式生物斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)材料，使用納米TiO2暴露培養(yǎng)斑馬魚，觀察隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，斑馬魚肝損傷基

79、因的表達(dá)情況。為斑馬魚肝損傷相關(guān)基因表達(dá)的分子機(jī)制提供參考，還可以為納米材料對(duì)生物的傷害研究提供一定的依據(jù)。為進(jìn)而研究納米材料的生物效應(yīng)提供一定的基礎(chǔ)。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，納米TiO2的加入對(duì)斑馬魚肝損傷相關(guān)基因造成了一定程度的影響。在培養(yǎng)初期，相關(guān)基因的表達(dá)均呈上升趨勢(shì)，表明納米TiO2促進(jìn)了相關(guān)基因的表達(dá)，這是機(jī)體自身保護(hù)機(jī)制的體現(xiàn)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同基因的表達(dá)呈多樣性。</p&g

80、t;<p>　　納米材料的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛，納米材料對(duì)人類生活許多方面將產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。例如環(huán)境保護(hù)和一些疾病的治療方法。我們面臨的挑戰(zhàn)是我們?nèi)狈Σ煌{米材料侵害生物可能帶來(lái)的一些負(fù)面結(jié)果信息。所以，研究納米材料對(duì)生物造成的傷害影響的意義重大。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　方源. 納米材料及其應(yīng)用[J]. 應(yīng)用科學(xué),

81、2010, 17: 146.</p><p>　　諸平. 新進(jìn)納米TiO2研究文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析[J]. 寶雞文理學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2010, 30(2): 33~41.</p><p>　　Yun YH, Hwang KJ, Wee YJ, et al. Synthesis, physical properties, and characterization of starch-bas

82、ed blend films by adding nano-sized TiO2/Poly(methy1 metacrylate-co-acrylamide) [J]. Journal of Applied Polymer Science, 2011, 120: 1850~1858.</p><p>　　Kim YH, Kim KS, Kwak NJ, et al. Cytotoxicity of yellow

83、sand in lung epithelial cells [J]. Journal of biosciences, 2003, 28: 77~81.</p><p>　　金珊珊, 吳新榮. 斑馬魚, 人類疾病研究的理想模式生物[J]. 生命的化學(xué), 2008, 28(3): 260~263.</p><p>　　方薇, 曾靜, 王付利. 模式生物斑馬魚在人類疾病中的應(yīng)用[J]. 醫(yī)學(xué)信息

84、, 2010, 2: 337~338.</p><p>　　李三強(qiáng), 崔旭紅, 馬靈筠, 等. 熱休克蛋白70研究現(xiàn)狀及展望[J]. 中華實(shí)用中西醫(yī)雜志. 2009, 22(4): 246~247.</p><p>　　常瑜, 孔祥會(huì). 魚類低氧誘導(dǎo)因子-1基因的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(32): 13998~14000.</p><p>

85、　　付世新, 張利, 齊長(zhǎng)學(xué), 等. 銅對(duì)CTR1基因mRNA表達(dá)的影響[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 21(6): 29~31.</p><p>　　于海林, 姜燕, 趙亮, 等. 卵巢癌細(xì)胞中hCTR1的表達(dá)與細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的相關(guān)研究[J]. 腫瘤, 2009, 29(10): 934~939.</p><p>　　許斌, 徐兆發(fā), 楊敬華. 鎘對(duì)大鼠Na+-K+-AT

86、Pase和Ca2+-ATPase影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病, 2005, 31(4): 197~199.</p><p>　　鄭惠梅, 程志強(qiáng), 楊廷桐. 食管癌中MDR基因表達(dá)及其臨床意義[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥, 2009, 7(5): 54~55.</p><p>　　李成梅, 劉容珍, 曹華斌. 真核細(xì)胞內(nèi)的銅轉(zhuǎn)運(yùn)及平衡機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 3

87、7(21): 10010~10011.</p><p>　　張燕, 肖婷婷, 沈祥春. 金屬硫蛋白的功能及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2010, 26(6): 821~824.</p><p>　　Norey CA, Cryer JK. Induction of metallothionein gene expression by cadmium and the meten

88、tion of the toxic metal in the tissues of rainbow trout [J]. Biochem Physiol, 1990, 97: 215~220.</p><p>　　侯彥峰, 張照斌, 胡建英. 皮質(zhì)醇影響青鮪鰓內(nèi)鈉鉀ATP酶基因表達(dá)的研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2009, 4(2): 212~217.</p><p>　　李守軍, 王洪斌

89、. HSP70研究進(jìn)展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2002, 11: 52~53.</p><p>　　劉迪秋, 葛鋒, 陳朝銀, 等. 重金屬銅、鎘對(duì)鯽肝臟基因表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2010, 17(6): 1243~1249.</p><p>　　曹文濤, 張?chǎng)? 黃強(qiáng). 糠醛對(duì)釀酒酵母應(yīng)激后HSP70基因表達(dá)量的研究[J]. 中國(guó)釀造, 2010, 6(219): 86

90、~87.</p><p>　　熊雷, 朱玲玲, 范明. HSP90對(duì)低氧誘導(dǎo)因子的調(diào)節(jié)作用[J]. 國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志, 2008, 28(4): 348~352.</p><p>　　Heerden DV, Vosloo A, Nikinmaa M. Effects of short-term copper exposure on gill structure, metallothi

91、nein and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) level in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)[J]. Aquatic Toxicology, 2004, 69:271~280.</p><p>　　周國(guó)強(qiáng), 陳春英, 李玉峰, 等. 納米材料生物效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2008, 35(9): 998~

92、1006.</p><p>　　[23] Hur E, Kim HH, Choi SM, et al. Reduction of hypxia-induced transcription through the repression of hypoxia-inducible factor-1 alpha/aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator DNA bind