畢業(yè)論文the construction of fas iii prokaryotic expression vectors

1、<p>　　The construction of fas III prokaryotic expression vectors </p><p>　　Abstract: Drosophila Fas gene is protein coding gene in testis, mainly expressed in hub cell. In this experiment, by means of g

2、ene cloning technique, the target gene FasIII was inserted into the plasmid vector PET28a which was digested by two enzymes of BamHI and HindⅢ. so as to construct the prokaryotic expression vector PET28a-fasⅢ, then the r

3、ecombinant plasmid was transformed into Escherichia coli TOP10, achieve Fas III gene prokaryotic expression. The plasmid vector was marked with kanamycin</p><p>　　Key words: Gene cloning；fasⅢ；the prokaryotic

4、 expression vector；</p><p>　　prokaryotic expression；</p><p>　　果蠅精巢fasⅢ基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建</p><p>　　摘 要：果蠅fasⅢ基因是蛋白編碼類(lèi)基因，在精巢中fasⅢ基因主要在hub cell中表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基因克隆技術(shù)，以PET28a質(zhì)粒為載體，選用BamHI、HindⅢ兩種酶做雙

5、酶切，將目的基因fasⅢ導(dǎo)入質(zhì)粒載體PET28a，從而構(gòu)建原核表達(dá)載體PET28a-fasⅢ，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，實(shí)現(xiàn)fasⅢ基因的原核表達(dá)。實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒載體用卡那抗性（Kanr ）標(biāo)記，只有轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌才能在涂有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。最終目的是實(shí)現(xiàn)fasⅢ蛋白的原核表達(dá)與純化，為以后制備多克隆抗體奠定基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：基因克??；fasⅢ基因；原核表達(dá)載體；原核表

6、達(dá)；</p><p><b>　　目錄</b></p><p>　　摘 要錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　1前言錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　1.1 果蠅精巢的基本特征錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　1.2 fasⅢ基因錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p>

7、<p>　　1.3載體 錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　1.4 抗菌素的抗性工作原理錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)材料與方法錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.1實(shí)驗(yàn)材料錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>

8、　　2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.1.3引物錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.1.4質(zhì)粒載體錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.2實(shí)驗(yàn)方法錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.2.1目的基因的獲取錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.2.2 酶切

9、錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.2.3瓊脂糖凝膠電泳法回收DNA錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.2.4 DNA片段的體外連接(目的基因?qū)胭|(zhì)粒載體)錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.2.5連接體系的轉(zhuǎn)化錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.2.6挑菌落做菌落PCR錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p&

10、gt;<p>　　2.2.7重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)管培養(yǎng)錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.2.8 PET28a-fasⅢ質(zhì)粒的少量制備錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.2.9重組質(zhì)粒雙酶切鑒定錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　3.1目的基因PCR

11、錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　3.2質(zhì)粒和目的基因片段酶切反應(yīng)錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　3.3 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA 錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　3.4 菌落PCR鑒定錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　3.5 質(zhì)粒制備的鑒定錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p

12、>　　3.6 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　四、討論錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　參考文獻(xiàn)錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　1.1 果蠅精巢的基本特征&

13、lt;/p><p>　　有兩個(gè)精巢，形狀為長(zhǎng)而卷曲狀的管狀，圖示1-2 [3]顯示出了精巢前端的結(jié)構(gòu)。精巢里有兩類(lèi)干細(xì)胞:生殖干細(xì)胞GSC和體節(jié)干細(xì)胞SSC。GSC有7-9個(gè)，位于精巢的頂端，與Hub cell（HC）直接接觸，HC是精巢GSC微環(huán)境的重要組成部分 [4]，SSC包裹在GSC周?chē)虷C共同構(gòu)成了GSC的“niche” [5]。同卵巢GSCs一樣 ,精巢的GSCs也通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂產(chǎn)生2個(gè)子代細(xì)胞，一個(gè)

14、仍然處于微環(huán)境中，與HC直接接觸，成為新的GSC，另一個(gè)遠(yuǎn)離微環(huán)境，發(fā)育為GB（gonialblast）細(xì)胞，走向分化。GB細(xì)胞經(jīng)四次胞質(zhì)不完全分裂形成一個(gè)16cell相連的合胞體。Fusome在GB中是圓形的，在分化的合胞體呈分支狀。每個(gè)GB或合胞體都被兩個(gè)SCCs圍繞著，持續(xù)調(diào)控它們的分化。</p><p>　　圖1-2 精巢前端的結(jié)構(gòu)</p><p>　　Fig.1-2 The le

15、ading-end structure of tesis</p><p>　　1.2 fasⅢ基因</p><p>　　干細(xì)胞研究是目前國(guó)際研究前沿的熱點(diǎn)之一，生殖干細(xì)胞GSC的研究對(duì)于干細(xì)胞維持與分化等領(lǐng)域，以及生殖醫(yī)學(xué)及其相關(guān)疾病等的治療都將提供有價(jià)值的資料。果蠅具有繁殖周期短、結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、擁有成熟的遺傳分析手段及豐富的遺傳學(xué)資源等特點(diǎn)；同時(shí)鑒于果蠅生殖干細(xì)胞分裂和分化發(fā)育過(guò)程中的細(xì)

16、胞譜系都研究得很清楚，故果蠅的精巢和卵巢是細(xì)胞和分子水平上研究干細(xì)胞生物學(xué)的理想系統(tǒng)。</p><p>　　fasⅢ基因是蛋白編碼類(lèi)基因，具有七個(gè)轉(zhuǎn)錄本，最早發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)細(xì)胞中，功能是以Ca2 +獨(dú)立的方式介導(dǎo)細(xì)胞粘附，在軸突發(fā)展、指導(dǎo)和束狀的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展發(fā)揮作用。 </p><p>　　果蠅精巢中fasⅢ基因主要在hub cell中表達(dá) [1]，利用fasIII基因的表達(dá)蛋白制備多克隆抗

17、體，進(jìn)行抗原抗體免疫熒光反應(yīng)，可以確定Hub細(xì)胞的位置[2]，從而有利于對(duì)果蠅精巢干細(xì)胞的研究。</p><p>　　1.3 載體 （Vectors）</p><p>　　廣義上通常把能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具叫載體。在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體 [6]。</p><p>　　1、基因工程對(duì)載體的要求：</p&g

18、t;<p>　?。?）具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，可提高載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率。</p><p>　?。?）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制原點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使得外源基因可在受體細(xì)胞中大量繁殖或穩(wěn)定遺傳。</p><p>　?。?）具有多種單一的核酸酶切位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))，可用于外源基因的插入，同時(shí)不影響載體的擴(kuò)增和繁殖。</p><p>　　（4）具有合適

19、的選擇標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測(cè)。</p><p>　?。?）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移，避免基因的非控制性擴(kuò)散，給人類(lèi)造成危害。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選用的PET28a為質(zhì)粒載體，長(zhǎng)度為5369bp 。</p><p>　　1.4 抗菌素的抗性工作原理</p><p>　　卡那霉素（kanamycin，Kan）殺菌原理：<

20、;/p><p>　　通過(guò)與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)讀。殺死細(xì)菌。</p><p>　　細(xì)菌抗性原理：Kanr 編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)材料與方法</b></p><p><b>　　2.1實(shí)驗(yàn)材料</b>&l

21、t;/p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器</p><p>　　表2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及廠(chǎng)家</p><p>　　Table 2.1 Experimental instruments and manufacturers</p><p><b>　　2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑</b></p><p>　　限制性核酸

22、內(nèi)切酶：BamHI HindⅢ</p><p>　　10×K Buffer通用Buffer</p><p><b>　　BSA</b></p><p>　　primerSTAR MAX premix</p><p><b>　　cDNA模板</b></p><p&g

23、t;<b>　　CIAP堿性磷酸酶</b></p><p><b>　　瓊脂糖</b></p><p><b>　　1×TAE緩沖液</b></p><p><b>　　溴化乙錠溶液EB</b></p><p>　　DNA分子量Marker15k

24、b</p><p>　　10×loading buffer</p><p><b>　　5M Nacl</b></p><p><b>　　苯酚、氯仿</b></p><p><b>　　無(wú)水乙醇</b></p><p><b>　　

25、75%乙醇溶液</b></p><p><b>　　T4 DNA連接酶</b></p><p>　　10×T4 DNA ligase buffer</p><p>　　Inoue 轉(zhuǎn)化緩沖液</p><p><b>　　DMSO二甲亞礬</b></p><p

26、><b>　　LB液體培養(yǎng)基</b></p><p>　　試劑盒：瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒離心柱型</p><p>　　質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）</p><p><b>　　2.1.3引物</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用的擴(kuò)增引物和測(cè)序序列均由生工生物工程上海有限公司合成部合成。&

27、lt;/p><p>　　引物片段：Fas-bamH/F： ataggatccCTCCTCAACGAAGGCATCG</p><p>　　Fas-Hind/R： ataaagcttctaGAGGCTGCTGCTGGGCGGTTTG</p><p><b>　　2.1.4質(zhì)粒載體</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒載體P

28、ET28a來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室保存。</p><p><b>　　2.2實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1目的基因的獲取</p><p><b>　　1、PCR反應(yīng)體系</b></p><p>　　表2.1 PCR反應(yīng)體系 150μl</p><p>　　Ta

29、ble 2.1 PCR reaction system(150μl)</p><p><b>　　2、PCR反應(yīng)程序</b></p><p>　　98℃ 5min</p><p>　　98℃ 20s</p><p>　　30 cycles 55℃ 20s</p><

30、;p>　　72℃ 1min30s</p><p>　　72℃ 5min</p><p>　　16℃ 4min</p><p>　　3、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)</p><p>　　（1）制備0.1％瓊脂糖凝膠：稱(chēng)取0.25g瓊脂糖，加入25ml1×TAE緩沖液，置微波爐加熱至完全融化，取出搖勻。</p&

31、gt;<p><b>　?。?）膠板的制備：</b></p><p>　　將塑料內(nèi)槽洗凈、晾干，放置于水平制膠器中，并放好樣品梳；</p><p>　　待膠液冷到60℃左右時(shí)，加入2—3μl的溴化乙錠，輕輕混勻后將膠液倒入塑料內(nèi)槽，至塑料板上形成一層膠面；</p><p>　　待膠液凝固后，將梳子輕輕垂直拔出；</p>

32、<p>　　將塑料內(nèi)槽取出放入電泳槽內(nèi)，并加入1×TAE緩沖液至電泳槽中使緩沖液浸沒(méi)膠面，高出凝膠。</p><p>　　（3）加樣：取約2μl10×loading buffer與2μl PCR產(chǎn)物混合均勻，用移液槍加到凝膠孔中，并用DL15000TM DNA Maker 做對(duì)照。</p><p>　?。?）電泳：蓋好電泳槽蓋子，接通電泳槽與電泳儀的電源，

33、選擇電泳電壓120V，開(kāi)始電泳。</p><p>　　（5）觀(guān)察結(jié)果：取出樣品，在紫外燈下觀(guān)察，攝像，根據(jù)片段大小判斷目的片段是否擴(kuò)增成功。</p><p><b>　　2.2.2 酶切</b></p><p>　　1、DNA產(chǎn)物的純化</p><p>　　產(chǎn)物共150μL，集中到1.5mL EP管，加無(wú)菌水至500μL

34、</p><p>　　（1）酚抽：在EP管中加入等體積，即500μL苯酚/氯仿混合液，顛倒混勻，室溫12000r/min離心5min，吸取上層液到新的EP管，吸約450μL</p><p>　?。?）加入1/10體積的5M NaCl（按450uL換算，即45μL NaCl）</p><p>　?。?）加入2-3倍體積無(wú)水乙醇1mL，混勻，4℃12000r/min離心

35、10min，吸走上清液，產(chǎn)物沉淀在底部。</p><p>　?。?）漂洗：用70%乙醇清洗沉淀1-2次，離心，徹底吸走上清液。</p><p>　?。?）干燥和溶解：自然干燥5min至殘留乙醇揮發(fā)干凈，加入20μL無(wú)菌水溶解。</p><p>　　2、酶切，體系如表2.2所示</p><p>　　表2.2 酶切體系 50μl</p

36、><p>　　Table 2.2 Enzyme digestion system(50μl)</p><p>　　溶液配好混勻后瞬時(shí)離心，使溶液集中于管底，放在37℃ 水浴鍋水浴1h；其中PET28a質(zhì)粒酶切管在水浴1h后需加入1μlCIAP，接著水浴30min。</p><p>　　2.2.3瓊脂糖凝膠電泳法回收DNA</p><p><

37、;b>　　制膠</b></p><p><b>　　切膠</b></p><p>　　瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒</p><p><b>　　操作步驟</b></p><p>　?。?）柱平衡步驟：向吸附柱CA2中加入500μl平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中

38、的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。</p><p>　?。?）將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入干凈的離心管中，稱(chēng)取重量。</p><p>　?。?）向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，50℃水浴放置10min，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。</p><p>　　（4）將上一步所得的溶液加入一個(gè)吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000

39、rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。</p><p>　?。?）將吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。</p><p>　?。?）重復(fù)操作步驟5</p><p>　?。?）將吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm離心2min，盡量除盡漂洗液。將吸

40、附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。</p><p>　?。?）將吸附柱CA2放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min。12000rpm離心2min收集DNA溶液。</p><p>　?。?）電泳檢測(cè)：分別取3μl酶切樣品與2μl 10×loading buffer混合后加到凝膠孔中開(kāi)始電泳，電泳結(jié)束后取出樣品，在紫外燈下觀(guān)察，攝像

41、。</p><p>　　2.2.4 DNA片段的體外連接(目的基因?qū)胭|(zhì)粒載體)</p><p>　　1、配制連接體系，各成分如表2.3所示，體系中外源基因量要多些，載體的量要少些；</p><p>　　表2.3 連接體系 10μl</p><p>　　Table 2.2 Connection system(10μl)</p&

42、gt;<p>　　2、混勻后用瞬時(shí)離心，使液體全部集中于管底；</p><p>　　3、將離心管放于16℃ 水浴鍋保溫過(guò)夜；</p><p>　　4、取出連接體系，利用感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2.2.5連接體系的轉(zhuǎn)化</p><p>　　取1管100μl的TOP10超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，在冰上化凍后，在無(wú)菌操作臺(tái)

43、里向EP管中加入7μl連接體系，用槍輕輕吹打混勻；</p><p>　　將EP管插在冰水復(fù)合物中冰浴30min；</p><p>　　將EP管放到42℃恒溫水浴鍋中保溫90s，然后迅速放到冰水復(fù)合物中冰浴2min；</p><p>　　在無(wú)菌操作臺(tái)里向EP管中加入1ml的含K的液體LB培養(yǎng)液，混勻后放于搖床上37℃振蕩培養(yǎng)45min，轉(zhuǎn)速為150rpm/min，使細(xì)

44、胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)；</p><p>　　45min之后，3000r/min離心3min</p><p>　　在無(wú)菌操作臺(tái)中棄去950μl上清液，余下的150μl用移液槍輕輕打勻，吸至含K的LB培養(yǎng)基平板中，用事先已經(jīng)加熱滅菌并冷卻后的三角推棒輕輕涂布均勻；</p><p>　　待涂布液干燥后，將平板37℃培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜培養(yǎng)。</p><p&g

45、t;　　2.2.6挑菌落做菌落PCR</p><p><b>　　1、PCR反應(yīng)體系</b></p><p>　　表2.4 PCR反應(yīng)體系 25μl</p><p>　　Table 2.4 PCR reaction system(25μl)</p><p>　　模板：陽(yáng)性對(duì)照—重組質(zhì)粒的連接體系</p>

46、<p><b>　　陰性對(duì)照—無(wú)菌水</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)組—待檢測(cè)的菌落</p><p><b>　　PCR反應(yīng)程序</b></p><p>　　97℃ 3min</p><p>　　94℃ 30s</p><p>　　30 cyc

47、les 52℃ 30s</p><p>　　72℃ 1min</p><p>　　72℃ 3min</p><p>　　16℃ 3min</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：以DNA Mamker和陽(yáng)性對(duì)照作參考，判斷實(shí)驗(yàn)組條帶大小是否正確，進(jìn)而判斷是否為陽(yáng)性克隆。</p><

48、p>　　2.2.7重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)管培養(yǎng)</p><p>　　經(jīng)過(guò)菌落PCR鑒定后，挑選4個(gè)初步鑒定是陽(yáng)性克隆的菌落轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。</p><p>　　將無(wú)菌操作臺(tái)滅菌后，取4個(gè)15mlEP管，分別加入約4ml含卡那霉素（Kan）的LB液體培養(yǎng)基。</p><p>　　用無(wú)菌槍頭挑取單菌落，在EP管的培養(yǎng)基中輕輕攪拌，并將槍頭打入EP管中，蓋緊管蓋，放于搖床上37℃振

49、蕩培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)速為180rpm/min。</p><p>　　2.2.8 PET28a-fasⅢ質(zhì)粒的少量制備</p><p>　　菌液保種：將選取的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，渾濁后分別取450μl菌液并各加入50μlDMSO于-20℃凍存。</p><p>　　用質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）提取并制備質(zhì)粒。</p><p><b>　　操作步驟

50、：</b></p><p>　　柱平衡步驟：向吸附柱CP3中加入500μl平衡液BL，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。</p><p>　　取1.5ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12000rpm離心1min，盡量吸除上清。</p><p>　　向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液P1（使用前已加入RNaseA）

51、,用移液槍徹底懸浮細(xì)菌沉淀。</p><p>　　向離心管中加入250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解，所用時(shí)間不超過(guò)5分鐘。</p><p>　　向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min。</p><p>　　將上一步收集的上清液用移液槍轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，盡量不

52、要吸出沉淀。12000rpm離心30sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。</p><p>　　向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。</p><p>　　向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放回收集管中。<

53、;/p><p><b>　　重復(fù)操作步驟（8）</b></p><p>　　將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心1min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除。</p><p>　　將吸附柱CP3置于一個(gè)感覺(jué)離心管中，向吸附膜中間部位滴加70μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。</p&

54、gt;<p>　　離心管中收集制備好的質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：分別取3μl提取的質(zhì)粒DNA 樣品與2μl 10×loading buffer混合后加到凝膠孔中開(kāi)始電泳，電泳結(jié)束后取出樣品，在紫外燈下觀(guān)察，攝像，根據(jù)片段大小判斷質(zhì)粒是否制備成功。</p><p>　　2.2.9重組質(zhì)粒雙酶切鑒定</p><p>　　1、酶切體系如表2.5所示</p>

55、<p>　　表2.5 酶切體系 30μl</p><p>　　Table 2.5 Enzyme digestion system(30μl)</p><p>　　溶液配好混勻后瞬時(shí)離心，使溶液集中于管底，放在37℃ 水浴鍋水浴1.5h；</p><p>　　2、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：</p><p>　　將所有雙酶切產(chǎn)物與

56、2μl 10×loading buffer混合后加到凝膠孔中開(kāi)始電泳，電泳結(jié)束后取出樣品，在紫外燈下觀(guān)察，攝像。以15 kb DNA Mamker作參考，判斷實(shí)驗(yàn)組條帶大小是否正確。</p><p><b>　　三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1目的基因PCR</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定結(jié)果如下圖

57、3-1所示，本實(shí)驗(yàn)所用DNA Marker為15000bp，DNA Marker：250-1000-5000-7500-10000-15000。目的基因fasⅢ為950bp,與Marker第二條帶（1000bp）基本對(duì)應(yīng)。說(shuō)明PCR產(chǎn)物為目的基因fasⅢ片段。</p><p>　　圖3-1 目的基因fasⅢ的PCR鑒定</p><p>　　Fig.3-1 Identification of

58、 PCR gene Fas III</p><p>　　1，2；目的基因片段M,DNA Marker；</p><p>　　3.2質(zhì)粒和目的基因片段酶切反應(yīng)</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定結(jié)果如下圖3-2所示，實(shí)驗(yàn)所用DNA Marker為15000bp，目的基因fasⅢ為950bp，與Marker第二條帶（1000bp）基本對(duì)應(yīng)。質(zhì)粒PET28a為5

59、369bp,位于Marker第三條帶（5000bp）和第四條帶（7500bp）之間。 </p><p>　　圖3-2 目的基因片段與質(zhì)粒酶切反應(yīng)后鑒定</p><p>　　Fig.3-2 The identification of target gene fragment and the plasmid </p><p>　　1，目的基

60、因fasⅢ的酶切結(jié)果；M，DNA Marker；2，質(zhì)粒PET28a酶切結(jié)果；</p><p>　　3.3 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA </p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定結(jié)果如下圖3-3所示，實(shí)驗(yàn)所用DNA Marker為15000bp，目的基因fasⅢ為950bp，與Marker第二條帶（1000bp）基本對(duì)應(yīng)。質(zhì)粒PET28a為5369bp,位于Marke

61、r第三條帶（5000bp）和第四條帶（7500bp）之間。目的條帶清晰明亮，回收效果較好。</p><p>　　圖3-3 DNA回收后鑒定</p><p>　　Fig.3-3 The identification of DNA recovery </p><p>　　1，質(zhì)粒PET28a；2，目的基因fasⅢ；M，DNA Marker；</p><

62、;p>　　3.4 菌落PCR鑒定</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：以DNA Mamker(15000bp)和陽(yáng)性對(duì)照作參考，其中,4是陽(yáng)性對(duì)照，M是DNA Mamker，1，2，3，5，為菌落PCR產(chǎn)物，條帶清晰明亮，與陽(yáng)性對(duì)照的條帶大小一致，說(shuō)明是陽(yáng)性克隆。</p><p>　　圖3-4菌落PCR的鑒定</p><p>　　Fig.3-4 The i

63、dentification of colony PCR</p><p>　　1，2，3，5，菌落PCR產(chǎn)物；4，陽(yáng)性對(duì)照；M，DNA Marker；</p><p>　　3.5 質(zhì)粒制備的鑒定</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定結(jié)果如下圖3-5所示，制備目的基因fasⅢ與PET28a的重組質(zhì)粒，片段大小約6000bp，以DNA Mamker(15000bp

64、)作參考，位于Marker第三條帶（5000bp）和第四條帶（7500bp）之間。其中1,2,3,分別對(duì)應(yīng)EP管上編號(hào)為3,4,10。</p><p>　　圖3-5 質(zhì)粒制備的鑒定</p><p>　　Fig.3-5 The Identification of plasmid</p><p>　　M，DNA Marker；1,2,3,重組質(zhì)粒；</p>

65、<p>　　3.6 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定</p><p>　　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定結(jié)果如下圖3-6所示，雙酶切后的產(chǎn)物為兩條帶，分別是目的基因fasⅢ片段與質(zhì)粒PET28a片段，其中目的基因片段與DNA Marker(15000bp)第一條帶對(duì)應(yīng)，質(zhì)粒PET28a片段與DNA Marker第四條帶對(duì)應(yīng)，</p><p>　　1，2，3，分別對(duì)應(yīng)EP管上編號(hào)為3，4，10

66、 </p><p>　　圖3-6 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定</p><p>　　Fig.3-６The recombinant plasmid was identified by double enzyme digestion</p><p>　　1，2，3，雙酶切產(chǎn)物；M，DNA Marker；</p>&

67、lt;p><b>　　四、討論</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了果蠅精巢fasⅢ基因原核表達(dá)載體，最終目的是實(shí)現(xiàn)fasⅢ蛋白的原核表達(dá)與純化，為以后制備多克隆抗體奠定基礎(chǔ)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還需將重組載體導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21，實(shí)現(xiàn)fasⅢ基因的高效表達(dá)，并通過(guò)鎳瓊脂糖凝膠層析法純化標(biāo)記蛋白。利用fasⅢ表達(dá)蛋白制備多克隆抗體，可用于抗原抗體免疫熒光反應(yīng)，從而標(biāo)記hub cell的位置，

68、更利于了解和研究果蠅精巢結(jié)構(gòu)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] Peter M. Snow, Allan J. Bieber,and Corey S. Goodman Fasciclin III: A Novel Homophilic Adhesion Molecule in Drosophila. Cel[J], 1989

69、: 313-323.</p><p>　　[2] Eihachiro Kawase1, Marco D. Wong1, Bee C. Ding1 and Ting Xie, Gbb/Bmp signaling is essential for maintaining germline stem cells and for repressing bam transcription in the Drosophila

70、 testis. The Company of Biologists [J], 2004,131(59): 1365-1375.</p><p>　　[3]Kawase,E.et al.Gbb/bmp signaling is essential for maintaining germline stem cells and for repressing bam transcription in the Dros

71、ophila testis.Development [J], 2004.131(6):1365-1375.</p><p>　　[4] Yamashita,Y. M.,M.T.Fuller,and D.L.Jones.Signaling in stem cell niches:lessons from the Drosophila germline. Journal of cell Science[J], 200

72、5.118(4):665-672.</p><p>　　[5]Decotto, E. and A.C.Spradling.The Drosophila ovarian and testis stem cell niches:similar somatic stem cell and signals.Developmental cell[J], 2005.9(4):501-510.</p><p

73、>　　[6]劉祥林，聶劉旺.基因工程[B].科學(xué)出版社，2005：59-98.</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　時(shí)光荏苒，歲月如梭。轉(zhuǎn)眼間美好的大學(xué)四年生活已經(jīng)接近了尾聲，經(jīng)過(guò)四年的學(xué)習(xí)我在各個(gè)方面都有所提高。生命不止，奮斗不息。大學(xué)生活的結(jié)束，意味著我要踏上新的征程，再次揚(yáng)帆起航。</p><p>　　經(jīng)過(guò)

74、多天的努力，逐漸完成了本科畢業(yè)論文的實(shí)驗(yàn)操作部分和寫(xiě)作部分。這次的經(jīng)歷讓我受益匪淺，同時(shí)也暴露出我在多方面的不足與缺陷。從開(kāi)始不熟練的實(shí)驗(yàn)操作到最后的獨(dú)立完成，從開(kāi)始寫(xiě)論文時(shí)的無(wú)從下手到最后的游刃有余，這一點(diǎn)一滴的進(jìn)步都是在和同學(xué)的互幫互助以及老師的耐心指導(dǎo)下取得的。</p><p>　　在論文實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和寫(xiě)作過(guò)程中，我得到了陳XX老師極大地幫助和耐心的指導(dǎo)。從課題的選擇、實(shí)驗(yàn)操作到項(xiàng)目的最終完成，陳老師始終耐心在

75、一旁給于指導(dǎo)，在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程之中，耐心的幫我解決遇到的問(wèn)題，每個(gè)步驟都力爭(zhēng)做到最好。在論文初稿到成稿的過(guò)程之中，不厭其煩的為我修改。陳老師嚴(yán)肅的科學(xué)態(tài)度，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)精神，精益求精的工作作風(fēng)，深深地感染和激勵(lì)著我并將積極影響我今后的學(xué)習(xí)和工作。陳老師是我的良師，不僅在畢業(yè)論文期間給力我很大的幫助，同時(shí)在我考研期間也給了我很多寶貴的意見(jiàn)。在此謹(jǐn)向陳老師致以崇高的敬意和誠(chéng)摯的謝意，愿您一生幸福，安康！</p><p>　

76、　感謝實(shí)驗(yàn)室所有成員：師姐朱XX、王X，師兄王X；同窗潘XX，曹XX，李XX。感謝你們的陪伴與幫助，尤其感謝師姐師兄對(duì)我的耐心指導(dǎo)和悉心解說(shuō)，給予我很大的幫助，讓我受益匪淺，在這里請(qǐng)接受我誠(chéng)摯的謝意。</p><p>　　最后，我要感謝我的母?！不諑煼洞髮W(xué)和生命科學(xué)學(xué)院在這四年</p><p>　　來(lái)對(duì)我的精心栽培。還有我的爸爸媽媽?zhuān)霉谩⒕司藢?duì)我生活方方面面的關(guān)心，你們是我堅(jiān)強(qiáng)的后盾