四種重金屬對(duì)淡水發(fā)光菌的聯(lián)合毒性研究[畢業(yè)論文+開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　　（二零 屆）</b></p><p>　　四種重金屬對(duì)淡水發(fā)光菌的聯(lián)合毒性研究 </p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 環(huán)境工程

2、</p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要：事實(shí)上，當(dāng)待測(cè)生物暴露在混合污染物中時(shí)，其所受的影響不是單一污染物

3、的作用的簡(jiǎn)單加和，而是各混合物中各組分相互影響，產(chǎn)生的聯(lián)合毒性作用，表現(xiàn)為加和作用、協(xié)同作用和拮抗作用。為了深入了解重金屬混合物的聯(lián)合毒性對(duì)發(fā)光細(xì)菌的作用，利用淡水發(fā)光細(xì)菌——青?；【鶴67(Vibrio qinghaiensis sp.nov-Q67)發(fā)光值的測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)以硫酸鎳，硝酸銅，硝酸鋇，六水合硝酸鈷為研究對(duì)象，在測(cè)得其單一EC50的基礎(chǔ)上，對(duì)上述物質(zhì)進(jìn)行二二自由組合，測(cè)得其聯(lián)合毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸鎳/硝酸銅，硫酸鎳/

4、六水合硝酸鈷，硝酸鋇/硝酸銅的聯(lián)合作用為拮抗作用，硝酸鋇/六水合硝酸鈷為相加作用，硝酸銅/六水合硝酸鈷協(xié)同作用。</p><p>　　關(guān)鍵詞：聯(lián)合毒性；發(fā)光細(xì)菌；二元混合物；重金屬。</p><p>　　Abstract: In fact ,When the test biological exposure to mixed pollutants,the influence is not

5、a single simple addition but a mixture of mutual influence of each component. The joint effects of substance in a mixture can be categorized as antagonism, synergism and only additive. Joint toxicity effects of heavy me

6、tals on luminescent bacteria Vibrio qinghaiensis sp.nov-Q67 was investigated in this paper. The experimental material is nickeloussulfate ，Nitric acid copper ，Nitric acid barium and Six</p><p>　　Keywords: j

7、oint toxicity; luminescent bacteria; binary mixtures; heavy metals.</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1 選題的背景、意義1</p><p>

8、;　　1.2 相加指數(shù)法相關(guān)概念1</p><p>　　1.2.1 相加指數(shù)法2</p><p>　　1.2.3 EC50的概念2</p><p>　　1.2.4 建議的毒性評(píng)價(jià)方法3</p><p>　　1.3 相關(guān)研究概況3</p><p>　　1.3.1我國(guó)發(fā)光菌的研究概況3</p>

9、;<p>　　1.3.2發(fā)光菌檢測(cè)法的應(yīng)用3</p><p>　　1.3.3 污染物聯(lián)合毒性研究5</p><p>　　2 理論與實(shí)驗(yàn)方法7</p><p>　　2.1 理論測(cè)試方法和計(jì)算方法7</p><p>　　2.1.1 單一毒性的測(cè)試方法7</p><p>　　2.1.2 聯(lián)合毒

10、性的測(cè)試方法7</p><p>　　2.1.3 理論計(jì)算方法7</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法8</p><p>　　2.2.1 實(shí)驗(yàn)原理8</p><p>　　2.2.2 試劑與儀器8</p><p>　　2.2.3 發(fā)光細(xì)菌凍干菌劑的復(fù)蘇9</p><p>　　2

11、.2.4 培養(yǎng)液的配置9</p><p>　　2.2.5 培養(yǎng)基的配置9</p><p>　　2.2.6 發(fā)光菌的培養(yǎng)9</p><p>　　2.2.7 毒性測(cè)試9</p><p>　　2.2.8 數(shù)據(jù)處理10</p><p>　　3 結(jié)果與討論11</p><p>　　

12、3.1 結(jié)果11</p><p>　　3.1.1單一毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄11</p><p>　　3.1.2二元混合物相對(duì)發(fā)光率11</p><p>　　3.1.3二元混合物的EC50min12</p><p>　　3.2 小結(jié)12</p><p><b>　　4 結(jié)論14</b>&

13、lt;/p><p><b>　　參考文獻(xiàn)15</b></p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 選題的背景、意義</p><p>　　隨著工業(yè)農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，大量污染物進(jìn)入環(huán)境。其中重金屬對(duì)環(huán)

14、境的影響是巨大的，會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康產(chǎn)生潛在的長(zhǎng)遠(yuǎn)的危害[1]，當(dāng)然對(duì)重金屬進(jìn)行毒性的測(cè)定也是刻不容緩的事。并且，有環(huán)境危險(xiǎn)因素對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康的有害效應(yīng)并不是單一污染物作用的結(jié)果，而是各種污染物混合作用的結(jié)果。待測(cè)生物暴露在混合污染物中時(shí)，由于混合物中各組分相互影響，會(huì)產(chǎn)生聯(lián)合毒性[2]作用，表現(xiàn)為加和作用、協(xié)同作用和拮抗作用[3-4]。</p><p>　?。ㄒ唬┦紫龋Ｗo(hù)環(huán)境，其中第一步就是正確監(jiān)

15、測(cè)環(huán)境污染的情況。目前主要是用物理儀器和化學(xué)分析相結(jié)合的方法。這類方法的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確定性和定量，但是其儀器設(shè)備往往價(jià)格昂貴，技術(shù)要求和使用成本很高，只能在實(shí)驗(yàn)室里使用，即使不考慮這些儀器的昂貴價(jià)格及其他不便因素，仍然有一個(gè)重要問題：這樣的毒物泄露到底對(duì)人類的健康有多大危害？尤其是中，遠(yuǎn)期危害，上述檢驗(yàn)是無(wú)法直接回答這個(gè)問題的。要回答對(duì)人群健康的影響，即對(duì)生物毒性大小的判斷，必須用生物醫(yī)學(xué)的方法對(duì)污染的生物毒性進(jìn)行分析。目前較常用的是檢測(cè)

16、污染物毒性的方法是從醫(yī)學(xué)物理學(xué)的方法引用過來的小鼠，魚，或藻類毒性實(shí)驗(yàn)，但其有不可克服的缺點(diǎn)，如時(shí)間長(zhǎng)，要有專門的人員操作，成本大，個(gè)體存在差異等。而應(yīng)用發(fā)光細(xì)菌來檢測(cè)污染物毒性則能克服這些缺點(diǎn)，具有方便、靈敏、高效進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[5-6] ，化合物對(duì)發(fā)光菌的毒性與對(duì)其它生物的毒性數(shù)據(jù)有一定的相關(guān)性[7]在有毒物質(zhì)的篩選和環(huán)境污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)等方面具有重要意義[8]。</p><p>　　作為微生物的

17、學(xué)術(shù)研究，發(fā)光菌是微生物中很獨(dú)特的微生物。雖然有關(guān)于微生物的發(fā)光能力是如何讓形成和展開的，在學(xué)術(shù)界上依舊沒有一致的答案，但是這并不影響它在實(shí)際研究中的廣泛應(yīng)用，顯示出其巨大的應(yīng)用價(jià)值。在實(shí)際環(huán)境毒性檢測(cè)中常用到的是海洋發(fā)光菌和淡水發(fā)光菌。其中海洋發(fā)光菌由于適應(yīng)高濃度的海水鹽度，所以檢測(cè)時(shí)，必須在相當(dāng)于海水鹽度的溶液中才能進(jìn)行。對(duì)于一般的淡水樣品，需要的NaCl的濃度為3％才能進(jìn)行測(cè)驗(yàn)。隨著發(fā)光菌應(yīng)用于環(huán)境污染的毒性檢測(cè)日益增多，許多研究

18、者發(fā)現(xiàn)，對(duì)于有些品種的樣品，其測(cè)驗(yàn)結(jié)果往往與其他生物測(cè)試的結(jié)果不大吻合，尤其是那些含有重金屬的樣品。究起原因，多數(shù)認(rèn)為是由于添加了高濃度的NaCl所致，于是，有學(xué)者擬用葡萄糖代替氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓，，使之與其海洋環(huán)境成等滲溶液，但效果并不理想結(jié)果重復(fù)性較差。因?yàn)槭购Ｑ缶掷m(xù)穩(wěn)定的發(fā)光，必須要有在高濃度的Na離子的存在。這就一直成為海洋型發(fā)光菌的在環(huán)境毒性檢測(cè)應(yīng)用的限制。</p><p>　　淡水發(fā)光菌-青?；【鶾9

19、]， 1985年我們從我國(guó)青海省的青海湖所產(chǎn)的青海裸鯉體表分離到70余株發(fā)光菌。經(jīng)鑒定，為弧菌屬的一個(gè)新種，被定義為青?；【Ｆ渚哂休^海洋發(fā)光菌更優(yōu)異的生理特征。對(duì)NaCl的耐受實(shí)驗(yàn)表明，NaCl濃度在1％時(shí)生長(zhǎng)良好，在5％時(shí)仍生長(zhǎng)和發(fā)光良好，8％時(shí)為其生長(zhǎng)的上限。表明起具有較強(qiáng)的耐鹽及耐高滲透壓的能力。在PH6至11范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)并發(fā)光。PH=9是其生長(zhǎng)和發(fā)光的最佳PH。明顯與其它發(fā)光菌的最適PH不同。并且，青?；【鸀榉侵虏【?，因此很

20、有利于應(yīng)用，現(xiàn)在在環(huán)境毒性檢測(cè)方面的應(yīng)用相當(dāng)方便。 </p><p>　　由于青?；【厥獾男再|(zhì)，在應(yīng)用于環(huán)境毒性檢測(cè)時(shí)其不要Na存在有能生長(zhǎng)發(fā)光良好，排除了額外加入NaCl可能造成的影響。并且，新鮮培養(yǎng)的青?；【茉谡麴s水里能良好發(fā)光，且穩(wěn)定發(fā)光課持續(xù)30min以上，因此，在淡水樣品的檢測(cè)中可以用蒸餾水做空白對(duì)照。而淡水樣品也不需要做任何額外添加物，直接將青?；【舆M(jìn)去就行了。此外，由于該細(xì)菌對(duì)PH有較寬的適應(yīng)

21、力，在PH為5．5～9．0之間均可以。也就是說，PH對(duì)青?；【陌l(fā)光影響可以忽略不計(jì)，因而一般不需要對(duì)樣品做PH的調(diào)整即可用于檢驗(yàn)。</p><p>　?。ǘ?其次，對(duì)于4種重金屬[10]對(duì)發(fā)光菌的急性毒性和聯(lián)合毒性研究在方法的選取上，使用相加指數(shù)法，判別方法簡(jiǎn)單，是最早研究聯(lián)合毒性的方法，方法較為成熟。在判別相加作用時(shí)具有較好的可靠性，曾得到較為廣泛的應(yīng)用。Tu法還可判斷有機(jī)混合物聯(lián)合毒性的強(qiáng)弱。重金屬的聯(lián)合

22、毒性作用主要有疊加，協(xié)同或拮抗作用。所謂疊加是指兩種離子產(chǎn)生的共同作用所產(chǎn)成的抑制發(fā)光的程度，比他們各自單獨(dú)作用時(shí)的啊，但小于單純的相加值，所謂協(xié)同，是指兩種離子共同作用時(shí)的發(fā)光率，大于他們單獨(dú)作用時(shí)的簡(jiǎn)單加和，而所謂拮抗作用則是指兩種離子共同作用的發(fā)光率反而小于他們單獨(dú)作用的抑光率，或至少小于其中一種離子的單獨(dú)作用的抑光率。</p><p>　　1.2 相加指數(shù)法相關(guān)概念</p><p&g

23、t;　　1.2.1 相加指數(shù)法</p><p>　　相加指數(shù)法是在毒性單位概念的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。毒性單位是指當(dāng)試驗(yàn)溶液的毒物濃度等于該毒物對(duì)某種水生生物的半數(shù)效應(yīng)濃度ρ(EC50)時(shí)，則試驗(yàn)溶液對(duì)水生生物的毒性強(qiáng)度就為一個(gè)毒性單位。根據(jù)這個(gè)原理，混合物中第i組分的毒性單位可表示為</p><p>　　x(TUi)=ci/ρ(EC50，i) (1)</p><p

24、>　　其中：ci為混合物中第i組分的濃度，ρ(EC50，i)為第i種化合物單獨(dú)作用時(shí)的半數(shù)效應(yīng)濃度。相加指數(shù)法最早是由Marking提出來的。若令M=∑x(TUi)，即各組分的毒性單位之和，則相加指數(shù)的計(jì)算公式可表示為：</p><p>　　AI=M-1 (M=1時(shí))</p><p>　　AI=1/M-1 (M<1時(shí))</p><p>　　AI=-

25、M+1 (M>1時(shí))</p><p>　　相加指數(shù)法的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)相加指數(shù)等于0時(shí)，為簡(jiǎn)單的相加作用；當(dāng)相加指數(shù)小于0時(shí)，為拮抗作用；當(dāng)相加指數(shù)大于0時(shí)，為協(xié)同作用。相加指數(shù)等于0是一種理想的相加作用，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，由于存在誤差，即使是相加作用，也很難恰好得到相加指數(shù)等于0的結(jié)果，因此Marking提出若相加指數(shù)的置信區(qū)間包含0，就認(rèn)為是相加作用隨著合成化合物種類的增加。</p><p

26、>　　1.2.3 EC50的概念</p><p>　　EC50即發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度降低50%時(shí)毒物的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，毒物濃度與菌體發(fā)光強(qiáng)度呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系。因而可以根據(jù)發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度判斷毒物毒性大小，用發(fā)光強(qiáng)度表征毒物所在環(huán)境的急性毒性。目前，毒性實(shí)驗(yàn)中采用的指示生物主要是水生生物，常見的有線蟲、發(fā)光菌(Photobacterium phosphoreum)、大型蚤、藻類、魚類、蝌蚪、幼蝦和夏吸蟲等，也包

27、括土壤動(dòng)物如蚯蚓。</p><p><b>　　建議毒性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)</b></p><p>　　樣品建議的毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)</p><p>　　1.3 相關(guān)研究概況</p><p>　　1.3.1我國(guó)發(fā)光菌的研究概況</p><p>　　120世紀(jì)50時(shí)年代，在我國(guó)首次有人做了相關(guān)研究。山東大學(xué)的薛

28、庭耀教授對(duì)我國(guó)的發(fā)光菌做了報(bào)道，之后其又陸續(xù)對(duì)發(fā)光菌的生理做了相關(guān)研究，因此薛庭耀教授可能是我國(guó)最先對(duì)我國(guó)的發(fā)光菌做出研究的人。之后20世紀(jì)70年代華東師范大學(xué)的生物系的楊頤康教授和葉履平副教授開展了對(duì)我國(guó)發(fā)光菌的研究，從海洋生物中分離了10個(gè)發(fā)光菌細(xì)菌菌株。在20世紀(jì)80年代，華東師范大學(xué)發(fā)光菌研究組從我國(guó)海域上分離得到上千發(fā)光細(xì)菌，經(jīng)分別鑒定有六個(gè)種。值得一提的是，在青海省發(fā)現(xiàn)了發(fā)光細(xì)菌，經(jīng)五年詳細(xì)的鑒定之后，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的菌種，而

29、且不需要NaCl就能生長(zhǎng)和發(fā)光，是一種罕見的淡水型發(fā)光細(xì)菌，就是青海弧菌，還有相關(guān)很多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行研究，對(duì)發(fā)光菌的研究取得了很大的進(jìn)展。</p><p>　　縱觀近10年來關(guān)于發(fā)光菌的研究，國(guó)內(nèi)大部分已轉(zhuǎn)向應(yīng)用方面，尤其是在環(huán)境毒物的檢測(cè)上，這方面的論文每年都發(fā)表很多，數(shù)量很多，最近也有將發(fā)光菌應(yīng)用于食品安全方面。</p><p>　　1.3.2 發(fā)光菌檢測(cè)法的應(yīng)用</p>

30、<p>　　由于 L . B .T 技術(shù)具有應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、相關(guān)性好，反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測(cè)中。</p><p>　?。?）海水污染毒性檢測(cè)應(yīng)：廈門大學(xué)鄭天凌[11]等人對(duì)廈門市廈門大學(xué)附近海濱的海水利用發(fā)光菌檢測(cè)法進(jìn)行了取樣研究，不僅對(duì)取樣的海域海水的水質(zhì)做出了科學(xué)的評(píng)價(jià)，而且還對(duì)發(fā)光菌檢測(cè)方法做了有意義的探索，發(fā)現(xiàn)鹽度對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度有明顯影響，過高過低都會(huì)抑制其發(fā)光強(qiáng)度

31、。</p><p>　?。?）重金屬污染的毒性檢測(cè)應(yīng)用：重金屬對(duì)發(fā)光菌的單一毒性及聯(lián)合毒性的研究，索常溫(25℃)下水中汞，鎘，銅和鋅對(duì)青海弧菌Q67的急性毒性效應(yīng)[12]，選取OD600值1．75最佳發(fā)光狀態(tài)菌液以RS990l生物發(fā)光光度計(jì)為測(cè)試設(shè)備，按照第一部分研究建立的測(cè)試體系，測(cè)定水中汞，鎘，銅和鋅對(duì)發(fā)光菌半數(shù)發(fā)光抑制效應(yīng)濃度(Ec50)，索常溫(25℃)下水中汞，鎘，銅和鋅對(duì)青?；【鶴67的急性毒性效應(yīng)

32、，獲得4種毒物的EC50，按毒性由小到大順序?yàn)榕c對(duì)金魚進(jìn)行研究的結(jié)果相一致。</p><p>　?。?）在檢測(cè)河流，湖泊沉積物或底泥的毒性[13]應(yīng)用：劉愛菊，孔繁翔2006年報(bào)道，為了評(píng)估疏浚太湖五里湖的沉積物的生物毒性的影響，他們利用發(fā)光菌檢測(cè)法對(duì)五湖里的沉積物進(jìn)行急性毒性測(cè)驗(yàn)，比較了疏浚前后，沉積物的毒性，并用淡水沉積物重金屬質(zhì)量基準(zhǔn)的結(jié)果做參比。他們得到，盡管疏?？梢杂行鳒p沉積物中的重金屬污染物的總量，

33、大不能顯著的消減其毒性</p><p>　?。?）發(fā)光菌在檢測(cè)大氣污染應(yīng)用：可以利用發(fā)光菌檢測(cè)大氣污染物很在就被認(rèn)識(shí)，吳自榮，章平等人報(bào)道了幾種人所共知的有害氣體對(duì)發(fā)光菌發(fā)光有抑制作用。但是其存在許多障礙，其中最主要的是怎樣精確定量氣體，并保證用于檢測(cè)的氣體有充分的機(jī)會(huì)接觸到發(fā)光菌而產(chǎn)生作用，影響到發(fā)光細(xì)菌。即便如此，在方法上存在著明顯的不能精確定量的特點(diǎn)，但仍然可以說，。應(yīng)用發(fā)光菌來快速評(píng)價(jià)大氣或工業(yè)廢氣的生物

34、毒性是可行的</p><p>　?。?）檢測(cè)工業(yè)固體廢棄物的毒性應(yīng)用：工礦企業(yè)在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的固體廢物，隨著生產(chǎn)的時(shí)序進(jìn)行而不斷增多，危害環(huán)境的惡果出現(xiàn)，因此對(duì)工礦企業(yè)廢棄物的處置日益受到關(guān)注，對(duì)其所造成的污染如何控制也是不容忽視的其中對(duì)生物毒性的檢測(cè)評(píng)估更是必須先行的工作，利用發(fā)光菌的機(jī)型毒性檢測(cè)方法對(duì)工業(yè)固體廢棄物進(jìn)行毒性檢測(cè)是很有效很方便的。1990年朱文杰和汪杰曾對(duì)此做過實(shí)驗(yàn)，得出采用固體廢棄物浸出液來

35、反映其毒性是可行的，發(fā)光菌急性毒性檢測(cè)方法具有足夠的靈敏度。謝思琴，顧宗濂報(bào)道了對(duì)幾種工業(yè)固體廢棄物用明亮發(fā)光桿菌凍干粉進(jìn)行急性毒性檢驗(yàn)。表明用發(fā)光菌檢測(cè)工業(yè)固體廢棄物的急性毒性事很可靠的，是可行的。此外，他們還對(duì)工業(yè)固體廢棄物經(jīng)處理后的毒性變化用發(fā)光菌進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，處理后毒性明顯降低，有的廢渣毒性已消除，有機(jī)物含量下降百分之四十至七十一，因此他們認(rèn)為，土地處理工業(yè)廢渣是一種和有效的處理方法</p><p>

36、;　　（6）食品保鮮包裝物毒性檢測(cè)應(yīng)用：2005年10月，我國(guó)國(guó)家之間總局對(duì)聚氯乙烯食品保鮮膜使用安全問題，通過對(duì)市場(chǎng)上存在的44種聚氯乙烯的食品保鮮膜進(jìn)行抽查，發(fā)現(xiàn)某些用聚氯乙烯單體制成的保鮮膜含有對(duì)人體有害的增塑劑，而此前這類產(chǎn)品常用于超市包裝新鮮水果，蔬菜。熟食等，由此，食品包裝膜的安全性引起了公共關(guān)注。有關(guān)于淡水發(fā)光菌Q67檢測(cè)毒性的論文早有發(fā)表，但是將其用于檢測(cè)人工高分子聚合物的毒性尚未見報(bào)道。有關(guān)人員通過淡水發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試

37、技術(shù)這一簡(jiǎn)單方法對(duì)市場(chǎng)上常見的食品保鮮包裝材料進(jìn)行生物毒性檢驗(yàn)?？捎枚拘詤⒈任锓宇悓?duì)發(fā)光菌的抑制情況與其樣品進(jìn)行比較。（苯酚類化合物在染料、炸藥、農(nóng)藥等生產(chǎn)中具有重要的地位，其取代酚是重要的化工原料或中間體，它們對(duì)人體具有潛在的致癌性，這些化合物大多屬于有毒有害物質(zhì)，在水體環(huán)境中廣泛存在，對(duì)水體生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖構(gòu)成危害，破壞了水體生態(tài)系統(tǒng)。取代酚類化合物對(duì)環(huán)境的污染一直被人們所關(guān)注，美國(guó)、日本等國(guó)家把取代酚類列入環(huán)境中的重點(diǎn)污染物

38、。Konemann指出：具有相似反應(yīng)機(jī)制的化合物，混合毒性可通過濃度的增加來確定，并提出了混合毒性指數(shù)（MTI），以此來評(píng)價(jià)多</p><p>　?。?）在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用：豬，牛和奶牛內(nèi)等動(dòng)物在飼養(yǎng)時(shí)，可能會(huì)接觸到抗生素或某些獸藥，所用飼料，新鮮草料等也可能受到某些重金屬的污染物。隨著食物鏈的傳遞殘留在動(dòng)物體內(nèi)，人通過食用便達(dá)到人體內(nèi)，固然會(huì)影響人的健康，鮮肉或牛奶及奶制品極有必要做有沒有污染毒性的檢驗(yàn)。華

39、東師范大學(xué)熊蔚蔚[15]，朱文杰等人，以牛奶的安全檢測(cè)為例，做了一系列的研究。該設(shè)計(jì)方案考慮了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)循序的濃度對(duì)發(fā)光菌的毒性表現(xiàn)，注意到單一毒性和多種毒性共存的總毒性表現(xiàn)，客觀的正確判斷樣品的食品安全。得出以下結(jié)論:在蒸餾水和牛奶中重金屬對(duì)發(fā)光菌的毒性不同，且水溶液中重金屬的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于牛奶中重金屬的毒性。通過構(gòu)建牛奶安全性評(píng)價(jià)等級(jí)與30min徐昂對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系，初步建立了發(fā)光菌牛奶實(shí)用安全性評(píng)價(jià)體系。</p><

40、;p>　?。?）國(guó)內(nèi)朱金國(guó)等人利用明亮發(fā)光桿菌，采用大量接種快速培養(yǎng)方法，制備出適宜檢測(cè)用的發(fā)光菌檢測(cè)液，建立了發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)四環(huán)素族抗生紊效價(jià)結(jié)果表明，在該檢測(cè)體系條件下，明亮發(fā)光桿菌與金霉累、土霉素和四環(huán)素效價(jià)的抑制效應(yīng)呈良好的線性關(guān)系，菌液與抗生素的作用最佳體積配比為l：3，相互作用的適宜時(shí)間為60至80min。該體系對(duì)四環(huán)素族抗生索的檢測(cè)靈敏度可達(dá)0．00625 5ug/ml, 比傳統(tǒng)的杯碟法高5倍，具有快速：簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可

41、作為食品中抗生素殘留的一種快速、靈敏的篩選檢測(cè)方法。</p><p>　　A．Kahru．，K．Tomoson,T．Pall等人利用明亮發(fā)光桿菌凍千粉對(duì)廣泛使用的13種殺蟲劑、除草劑和14種溶劑，按,照,,Biotox進(jìn)行了測(cè)試，測(cè)試所得數(shù)據(jù)為5min的ECho值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毒性最大的殺蟲劑是五氯苯酚(EC50=55mg／1)，毒性最小的是百草枯EC50=14800lm/l，所得數(shù)據(jù)同Microtox 方法、動(dòng)物的

42、半致死方法比較發(fā)現(xiàn)：Biotox方法與Microtox方法的農(nóng)藥與溶劑，農(nóng)藥，溶劑的相關(guān)性分別是0．78，0．37，0．95。同時(shí)。有些農(nóng)藥因?yàn)榧佑腥軇┑年P(guān)系會(huì)減弱農(nóng)藥的毒性，所以部分物質(zhì)的數(shù)據(jù)采用5min的EC20值。</p><p>　　1.3.3污染物聯(lián)合毒性研究展望 </p><p>　　混合污染物聯(lián)合毒性研究始于1939[16]年，經(jīng)過近70年的發(fā)展，已經(jīng)成功發(fā)展了Tu[17]

43、(毒性單位)法AI(加和指數(shù))法[18]、MTI(混合毒性指數(shù))法[19]及入(相似參數(shù))法[20]。這些方法都能根據(jù)實(shí)驗(yàn)和相應(yīng)公式的計(jì)算結(jié)果簡(jiǎn)單判別混合物的聯(lián)合作用方式為拮抗、獨(dú)立、相加及協(xié)同。然而，隨著新化學(xué)品的不斷問世及聯(lián)合毒性的復(fù)雜性和多變性，越來越多科學(xué)研究者發(fā)現(xiàn)這些方法只能定性判斷污染物的聯(lián)合作用方式，并不能判斷其作用的程度，因此，他們呼吁聯(lián)合毒性的研究必須進(jìn)入到定量研究階段。從20世紀(jì)90年代始，混合污染物聯(lián)合毒性研究有了

44、一定的進(jìn)展，先后提出以Tu和入為參數(shù)的定量研究方法和混合化合物的定量結(jié)構(gòu)一活性相關(guān)M—QSAR[15]法，初步建立了M—QSAR的理論框架，但如何建立一套能有效定量預(yù)測(cè)混合物的毒性目前還一直是國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)。</p><p>　　2 理論與實(shí)驗(yàn)方法</p><p>　　2.1 理論測(cè)試方法和計(jì)算方法</p><p>　　2.1.1 單一毒性的測(cè)試方法<

45、/p><p>　　根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將待測(cè)化合物用蒸餾水配成7個(gè)質(zhì)量濃度梯度（100~0.0001mg·L-1）。磁力攪拌均勻后用移液槍取兩毫升加入平底玻璃管中，以2.0mL蒸餾水做空白對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度設(shè)2組平行。將培養(yǎng)好的斜面用適量蒸餾水洗下稀釋(控制空白對(duì)照管發(fā)光強(qiáng)度在發(fā)光儀的量程內(nèi))，磁力攪拌均勻后，然后使用分光光度計(jì)測(cè)得菌懸液的A600=0.4～0.5之間，取0.2mL于各玻璃管中，充分振蕩，1

46、5min時(shí)用生物毒性測(cè)試儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。用直線內(nèi)插法求出相對(duì)發(fā)光率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的化合物質(zhì)量濃度，即為該種化合物對(duì)發(fā)光菌半數(shù)發(fā)光抑制質(zhì)量濃度EC50。每組質(zhì)量濃度梯度設(shè)2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10％。</p><p>　　2.1.2 聯(lián)合毒性的測(cè)試方法</p><p>　　根據(jù)單一毒性試驗(yàn)結(jié)果，將硫酸鎳，硝酸銅，硝酸鋇，六水合硝酸鈷四種混合物 二二自由組合，二元混合體系按毒性比1∶1

47、設(shè)置聯(lián)合毒性試驗(yàn)的質(zhì)量濃度梯度，測(cè)各混合體系的EC50。測(cè)定方法與單一體系相同。每組質(zhì)量濃度梯度設(shè)2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過10％。</p><p>　　2.1.3 理論計(jì)算方法</p><p>　　測(cè)得的樣品溶液的發(fā)光強(qiáng)度與空白樣的發(fā)光強(qiáng)度之比即為相對(duì)發(fā)光率，用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分</p><p>　　析軟件的probit分析方法計(jì)算相對(duì)發(fā)光率為50%時(shí)的半

48、數(shù)抑制濃度EC50。</p><p>　　在發(fā)光菌毒性測(cè)試中，隨著毒性物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值（RLU）下降。通常將RLU下降到起始數(shù)值的50%的毒性物質(zhì)質(zhì)量濃度定義為1個(gè)毒性單位（TU）。因此，對(duì)于重金屬的單一體力，1TU對(duì)應(yīng)于其EC50。</p><p><b>　　TU=ρ/EC50</b></p><p>　　式中，TU為毒性

49、單位；ρ為單一體系中重金屬質(zhì)量濃度。</p><p>　　對(duì)于多元混合體系，可根據(jù)以下方程計(jì)算出混合體系的毒性單位（TUmix）。</p><p>　　TUmix=ρ(a-m)/ρ(a-t)+ρ(b-m)/ρ(b-t)</p><p>　　式中，a、b-分別代表二元混合物中的2種重金屬；ρ(a-m)、ρ(b-m)–分別表示其在混合體系中的質(zhì)量濃度；ρ(a-t)、ρ(

50、b-t)–分別表示單一體系中重金屬的EC50；TUmix-二元混合體系的毒性單位。</p><p>　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得二元混合體系的RLU值和上面計(jì)算的二元混合體系TU按照下述方程求出抑制率T和TUmix之間的線性關(guān)系。</p><p>　　T=a+b[TUmix]×100%</p><p>　　式中，T-抑制率，定義為實(shí)驗(yàn)組RLU與對(duì)照組RLU比值；a、b

51、-線性方程的常數(shù)系數(shù)。</p><p>　　根據(jù)此線性關(guān)系可推算出T=50%時(shí)，二元混合體系的TUmix，即為此時(shí)二元混合體系的實(shí)測(cè)EC50mix。由此可見，當(dāng)EC50mix=1TU時(shí)，混合物的聯(lián)合作用方式表現(xiàn)為相加作用，當(dāng)EC50mix＞1TU或EC50mix＜1TU時(shí)，混合物的作用方式為拮抗作用或協(xié)同作用。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b>&

52、lt;/p><p>　　2.2.1 實(shí)驗(yàn)原理</p><p>　　發(fā)光桿菌是一種海洋發(fā)光細(xì)菌，屬一類非致病的革蘭氏陰性兼厭氧細(xì)菌，它們?cè)谶m當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)培養(yǎng)后,能發(fā)出肉眼可見的藍(lán)綠色的光。其發(fā)光原理是由于活體細(xì)胞內(nèi)具有ATP、熒光素(FMN)和熒光酶等發(fā)光要素。這種發(fā)光過程是細(xì)菌體內(nèi)的一種新陳代謝過程，即氧化呼吸鏈上的光呼吸過程。當(dāng)細(xì)菌合成熒光酶、熒光素、長(zhǎng)鏈脂肪醛時(shí)，能發(fā)生生化反應(yīng)，便產(chǎn)生光

53、。生化反應(yīng)如下：</p><p><b>　　基質(zhì)</b></p><p>　　↓ ATP ATP ATP</p><p>　　還原型輔酶A→黃素（H2）→細(xì)胞色素C→O2</p><p><b>　　↓</b></p><p>

54、;<b>　　載氫黃素單核苷酸</b></p><p><b>　　熒光酶（E）↓O2</b></p><p>　　↓ RCHO RCOOH</p><p>　　E-FMNH2→E-FMNH——→光+FMN+電子+H2O</p><p><b>　　↓</b></p

55、><p><b>　　OOH</b></p><p><b>　　暗反應(yīng)↓</b></p><p>　　電子+黃素單核苷酸+H2O2</p><p>　　當(dāng)細(xì)胞活性高，處于積極分裂狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞ATP含量高，發(fā)光強(qiáng)；休眠細(xì)胞ATP含量明顯下降，發(fā)光弱；當(dāng)細(xì)胞死亡，ATP立即消失，發(fā)光停止。</p&g

56、t;<p>　　處于活性期的發(fā)光菌，當(dāng)加入毒性物質(zhì)（如重金屬離子Cu2+、Cd2+、Se4+、Zn2+、As3+、Pb2+,農(nóng)藥五氧吩嗪、福美雙、染料對(duì)氨基苯甲醚、對(duì)硝基鄰甲苯胺，酸、堿等），菌體就會(huì)受抑甚至死亡，體內(nèi)ATP含量也會(huì)隨之降低甚至消失，發(fā)光度便下降甚至到零。由于毒物濃度與菌體發(fā)光度呈線性負(fù)相關(guān)地變化，因而可根據(jù)發(fā)光度確定毒物生物毒性。若此毒物知其成份而不知其濃度，則可根據(jù)先前測(cè)得的發(fā)光度—毒物濃度關(guān)系曲線（標(biāo)

57、準(zhǔn)曲線），測(cè)定濃度。</p><p>　　2.2.2 試劑與儀器</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用的4種重金屬化合物均為分析純。</p><p>　　發(fā)光菌采用青?；【鶴67(Vibrio–qinghaiensis sp.—Q67)，購(gòu)自華東師范大學(xué)生物系。</p><p>　　DXY-2型生物毒性測(cè)試儀（中國(guó)科學(xué)南京土壤研究所）。</

58、p><p>　　THZ-C恒溫振蕩器(江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)備廠)。</p><p>　　隔水式培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，比色管架。</p><p>　　2.2.3 發(fā)光細(xì)菌凍干菌劑的復(fù)蘇</p><p>　　從2~5℃室取出發(fā)光細(xì)菌凍干粉安培瓶和蒸餾水，打開瓶頸，用1mL注射器吸取0.5mL冷的蒸餾水（適用于5mL測(cè)試管）或1mL冷的蒸餾水（適用于2mL測(cè)

59、試管）注人已開口的凍干粉安培瓶。務(wù)必充分混勻！投入置有冰塊的小號(hào)（1~1.5L）保溫瓶。2分鐘后菌即復(fù)蘇發(fā)光。</p><p>　　2.2.4 培養(yǎng)液的配置</p><p>　　酵母膏 5.0g</p><p>　　胰蛋白胨 5.0g</p><p>　　Na2HPO4

60、 5.0g</p><p>　　KH2PO4 1.0g</p><p>　　甘油 3.0g</p><p>　　pH 7.0±0.5</p><p>　　2.2.5 培養(yǎng)基的配置</p><

61、;p>　　培養(yǎng)液（按上述配方）1000mL</p><p>　　瓊脂粉 16g</p><p>　　pH 7.0±0.5</p><p>　　2.2.6 發(fā)光菌的培養(yǎng)</p><p>　　將裝有凍干粉的安培瓶先置于4℃冰箱內(nèi)約10～15min，在超凈工作臺(tái)中切開安

62、培瓶，取已滅菌的蒸餾水100uL點(diǎn)在培養(yǎng)皿平板上，用接種針取一環(huán)菌種蘸去點(diǎn)的溶液在平板上劃線，倒置放于恒溫培養(yǎng)箱中于22℃培養(yǎng)24h；挑取單個(gè)菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，于22℃培養(yǎng)24小時(shí)候后轉(zhuǎn)接于斜面，將培養(yǎng)好的第3代斜面置4℃冰箱備用；將培養(yǎng)好的菌種接種到50mL液體培養(yǎng)基中，22℃振蕩培養(yǎng)16～24h，待用。</p><p>　　2.2.7 毒性測(cè)試</p><p>　　該實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)

63、溫度20℃條件操作，實(shí)驗(yàn)前24h配置待測(cè)樣品儲(chǔ)備液，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定適當(dāng)?shù)臐舛确秶淠康氖钦页霭l(fā)光抑制率在50%上下時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度。具體做法是假定母液的濃度為a，預(yù)試驗(yàn)的濃度范圍為0.1a，0.01a，0.001a，0.0001a。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，找出發(fā)光抑制率在50%上下時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度范圍，接著按等對(duì)數(shù)間距用蒸餾水稀釋儲(chǔ)備液配制數(shù)個(gè)濃度梯度，當(dāng)然不同的化合物測(cè)定結(jié)果不同。而后分別取2mL注入具塞磨口比色管（1.2cm5.0cm），每個(gè)測(cè)試

64、濃度設(shè)置三個(gè)平行對(duì)照組和一個(gè)空白對(duì)照組；取2mL已經(jīng)培養(yǎng)好的菌液置于盛有適量蒸餾水的三角瓶中，用磁力攪拌器強(qiáng)力攪拌30min，吸取0.5mL菌種稀釋液注入各比色管，加塞，上下強(qiáng)力振蕩10次，去塞，用DXY-2型生物毒性測(cè)試儀測(cè)定15min時(shí)的發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度。</p><p>　　2.2.8 數(shù)據(jù)處理</p><p>　　測(cè)得的樣品溶液的發(fā)光強(qiáng)度與空白樣的發(fā)光強(qiáng)度之比即為相對(duì)發(fā)光率，用SP

65、SS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的probit分析方法計(jì)算相對(duì)發(fā)光率為50%時(shí)的半數(shù)抑制濃度EC50。再根據(jù)毒性單位法，計(jì)算混合物的毒性單位（TU），確定混合物的作用方式。</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論</b></p><p><b>　　3.1 結(jié)果</b></p><p>　　3.1.1 單一毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記

66、錄 </p><p>　　表1 單一體系重金屬的EC50</p><p>　　3.1.2 二元混合物的相對(duì)發(fā)光率</p><p>　　表2-二元混合物的相對(duì)發(fā)光率</p><p>　　圖1 二元混合物的TU-RLU圖</p><p>　　二元混合物的EC50mix</p><p>　　表3

67、二元混合物的EC50mix</p><p><b>　　3.2 討論</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)表明：?jiǎn)我蜃釉囼?yàn)時(shí)，當(dāng)分別用不同濃度的鎳，鋇，銅，鈷等離子單獨(dú)作用于發(fā)光菌時(shí)，這四種離子均顯示在較低濃度時(shí)先出現(xiàn)刺激發(fā)光菌發(fā)光，然后再隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸轉(zhuǎn)化為抑制發(fā)光菌的發(fā)光。由刺激發(fā)光轉(zhuǎn)化為抑制發(fā)光所需的時(shí)間對(duì)于不同的重金屬種類是不同的，通常是毒性較強(qiáng)的重金

68、屬刺激發(fā)光所持續(xù)的時(shí)間較短。對(duì)于同一離子不同濃度時(shí)，在其低濃度刺激發(fā)光菌的時(shí)間較長(zhǎng)，濃度高的一開始就出現(xiàn)抑制發(fā)光的現(xiàn)象，看不到刺激發(fā)光的現(xiàn)象。 </p><p>　　又實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，獲得的EC50值，分別為硝酸鋇＞硫酸銅＞硫酸鎳＞六水合硝酸鈷，即單一重金屬的毒性為鈷＞捏＞銅＞鋇，這與以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的一致性。根據(jù)表一得到四種重金屬的半致死濃度，研究各金屬的和毒性時(shí)，溶液的配制采用等毒性混合的方法，即混合物中

69、各組分的毒性比(TR)等于l，每種混合物設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度組，分別為2TU,1.5TU,1TU及0.5TU，1組空白對(duì)照（蒸餾水），每組2個(gè)平行樣本，得到的數(shù)據(jù)如表二。由表3的，硫酸鎳/硝酸銅，硫酸鎳/六水合硝酸鈷，硝酸鋇/硝酸銅，硝酸鋇/六水合硝酸鈷，硝酸鋇/六水合硝酸鈷的EC50mix分別為1.1TU,1.86TU,1.54TU,1.06TU,0.86TU?？傻贸隽蛩徭?硝酸銅，硫酸鎳/六水合硝酸鈷，硝酸鋇/硝酸銅的聯(lián)合作用為拮抗作用

70、，硝酸鋇/六水合硝酸鈷為相加作用，硝酸銅/六水合硝酸鈷協(xié)同作用。</p><p>　　雙因子實(shí)驗(yàn)反映出不同離子彼此之間確實(shí)有影響，而不是單一毒性的簡(jiǎn)單加和，提醒我們?cè)趯?shí)際檢驗(yàn)中應(yīng)該對(duì)兩元混合物的毒性分析結(jié)果給予更仔細(xì)的考慮。</p><p>　　在此實(shí)驗(yàn)中，硫酸鎳/六水合硝酸鈷相互作用在擬合線性曲線時(shí)R2較小，存在較大的誤差，一方面自己操作存在問題，一方面也顯示污染物的聯(lián)合毒性這與是一個(gè)很

71、復(fù)雜的問題，其聯(lián)合作用效應(yīng)不僅與污染物的組成有關(guān)，也與測(cè)試生物有關(guān)。此外，聯(lián)合作用效應(yīng)的性質(zhì)還與所暴露的劑量有關(guān)。對(duì)于聯(lián)合作用的機(jī)理尚知不多，這些都有待于進(jìn)一步研究。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　應(yīng)用新型淡水發(fā)光菌-青海弧菌Q67（vibroqinghaiensis sp.nov-Q67）研究了鈷，鎳，銅，鋇，單因素因子及鎳/銅

72、、鎳/鈷、鋇/銅、鋇/鈷、銅/鈷5種二因素因子對(duì)青?；【牡亩拘匝芯俊?lt;/p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鎳/銅、鎳/鈷、鋇/銅3種二元混合體系對(duì)Q67的聯(lián)合毒性作用方式為拮抗作用；鋇/鈷二元混合體系對(duì)Q67聯(lián)合毒性作用方式為相加作用，鈷/銅為協(xié)同作用。同時(shí)可以看到發(fā)光菌對(duì)生物的毒性研究具有測(cè)試速度快，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，高效的特點(diǎn)，且與之前的生物毒性研究的符合程度也較高。 </p><p&g

73、t;<b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1]吳淑杭,徐亞同,凌云,等.生物發(fā)光法在農(nóng)產(chǎn)品安全性檢測(cè)中的應(yīng)用前景[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2006,25(增刊):421-424.</p><p>　　[2]閻 鵬，孫 禮，李百祥.利用發(fā)光菌快速檢測(cè)環(huán)境污染物急性毒性的研究概況[J].環(huán)境與健康雜志,2001,18(4):250-252. </p&g

74、t;<p>　　[3]周文富. 鹵代苯和苯酚衍生物的位電荷密度能和logKow與-1gLC50的QSAR研究[J]. 有機(jī)化學(xué), 2002, 22(9): 658- 662.</p><p>　　[4]KAISER K L E,PALABRICA V S.Photobacterium phosphoreum toxicity data index[J].Water pollut Res J Can,

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76、　[7]Kaiser K L E. Correlations of vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms[J]. Environmental Health Perspectives. 1998, 106(Supplement 2): 583-591.</p><p>　　[8]閻 鵬，孫 禮，李百祥.利用

77、發(fā)光菌快速檢測(cè)環(huán)境污染物急性毒性的研究概況[J].環(huán)境與健康雜志,2001,18(4):250-252.</p><p>　　[9]劉清，馬梅.Cu,Zn,Cd,Hg對(duì)青海弧菌（Q67菌株）聯(lián)合毒性作用的研究.中國(guó)環(huán)境科學(xué)，1997.17(4):301-303.</p><p>　　[10]包堅(jiān)敏,王志錚,陳啟恒,楊陽(yáng),袁久堯.4種重金屬對(duì)泥螺的急性毒性和聯(lián)合毒性研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)

78、報(bào)（自然科學(xué)版）,2007,26(3):253.</p><p>　　[11] 莫凌云,劉海玲,劉樹深.5種取代酚化合物對(duì)淡水發(fā)光菌的聯(lián)合毒性[J],生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2006，1(3):259-265</p><p>　　[12] 莫凌云,劉海玲,劉樹深.5種取代酚化合物對(duì)淡水發(fā)光菌的聯(lián)合毒性[J],生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2006，1(3):259-265.</p><p>

79、　　[13] 蘇麗敏,苯胺、苯酚類化合物對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性研究[J],環(huán)境科學(xué),2003. 12:57-61</p><p>　　[14] 孟慶俊,肖昕.不同方法對(duì)聯(lián)合毒性作用的評(píng)價(jià)[J],污染防治技術(shù)，2004,17(1):55-6</p><p>　　[15] 閻 鵬，孫 禮，李百祥.利用發(fā)光菌快速檢測(cè)環(huán)境污染物急性毒性的研究概況[J].環(huán)境與健康雜志,2001,18(4):250-2

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81、eavy metals in the encironment.Canada,Toronto,October 27-31,1975[C]. </p><p>　　[18Marking L L.Method for assessing additive toxicity of chemical mixtures[J].Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation,ASTM STP

82、Publication 634,1977,99-108.</p><p>　　[19]Konemann H.Fish toxicity tests with mixtures of more than two chemicals:A proposal for a quantitative approach and experimental results[J].Toxicology,1981,19:229-238

83、.</p><p>　　[20]Christensen E R,Chen C.Modeling of Combined Toxic Effects of Hazard Assessment of Chemicals[M].NY:Hemispere Publishing,1989,(6):125-186.</p><p><b>　　文獻(xiàn)綜述</b></p>

84、<p>　　發(fā)光細(xì)菌在環(huán)境毒性檢測(cè)中的應(yīng)用</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　目前對(duì)環(huán)境毒性的檢測(cè)主要是用物理儀器和化學(xué)分析相結(jié)合的方法。這類方法的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確定性和定量，但是其儀器設(shè)備往往價(jià)格昂貴，技術(shù)要求和使用成本很高，只能在實(shí)驗(yàn)室里使用毫無(wú)疑問，上述檢測(cè)方法不能預(yù)測(cè)對(duì)人體的影響尤其是中長(zhǎng)期的影響。要回答對(duì)人群健康的影響，

85、即對(duì)生物毒性大小的判斷，必須用生物醫(yī)學(xué)的方法對(duì)污染的生物毒性進(jìn)行分析。目前較常用的是檢測(cè)污染物毒性的方法是從醫(yī)學(xué)物理學(xué)的方法引用過來的小鼠，魚，或藻類毒性實(shí)驗(yàn)，但其有不可克服的缺點(diǎn)，如時(shí)間長(zhǎng)，要有專門的人員操作，成本高，個(gè)體存在差異等。而應(yīng)用發(fā)光細(xì)菌來檢測(cè)污染物毒性則能克服這些缺點(diǎn)，具有快速，靈敏且容易進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。在有毒物質(zhì)的篩選和環(huán)境污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)等方面具有重要意義[3]</p><p>　　就

86、當(dāng)前，對(duì)發(fā)光菌的研究已轉(zhuǎn)向應(yīng)用方面，尤其是在環(huán)境毒物的檢測(cè)上，這方面的論文每年都發(fā)表很多，數(shù)量很多，最近也有將發(fā)光菌應(yīng)用于食品安全方面。</p><p><b>　　正文</b></p><p>　　隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，排放到環(huán)境中的污染物質(zhì)越來越多。故在環(huán)境中各種污染物不是單獨(dú)存在的，而往往是以組合形式存在的多種污染物混合在一起所造成的復(fù)合污染日益受。到人們的重視，其

87、往往表現(xiàn)出相加、拮抗和協(xié)同作用[45]。因此促進(jìn)了聯(lián)合作用研究方法的發(fā)展。混合污染物聯(lián)合毒性研究始于1939[6]年，經(jīng)過近70年的發(fā)展，已經(jīng)成功發(fā)展了TU(毒性單位)法[7]、AI（加和指數(shù)）法[8]、MTI(混合毒性指數(shù))法[9]及λ（相似參數(shù)）法[10]。這些方法都能根據(jù)實(shí)驗(yàn)和相應(yīng)公式的計(jì)算結(jié)果簡(jiǎn)單判別混合物的聯(lián)合作用方式為拮抗、獨(dú)立、相加及協(xié)同。隨著混合污染物聯(lián)合毒性研究的不斷深入，污染物聯(lián)合毒性已經(jīng)由最初的定性研究階段向定量研

88、究階段過渡。這些方法都能根據(jù)實(shí)驗(yàn)和相應(yīng)公式的計(jì)算結(jié)果簡(jiǎn)單判別混合物的聯(lián)合作用方式為拮抗、獨(dú)立、相加及協(xié)同。</p><p>　　發(fā)光細(xì)菌在環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用主要有檢測(cè)水體污染毒性（主要包括海水污染的毒性檢測(cè)，河流污染的水質(zhì)檢測(cè)，河流水質(zhì)狀況的檢測(cè)，對(duì)排污口水質(zhì)毒性的檢測(cè)，城市污水毒性的評(píng)估，對(duì)工業(yè)廢水的生物毒性檢測(cè)，檢測(cè)重金屬污染的水質(zhì)毒性，多種重金屬存在時(shí)對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性等），檢測(cè)河流，湖泊沉積物或底泥的毒性，

89、檢測(cè)大氣污染，檢測(cè)土壤污染，檢測(cè)工業(yè)固體廢棄物的毒性，還包括食品保鮮包裝物毒性檢測(cè)，和食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用。</p><p>　　1.海水污染毒性檢測(cè)應(yīng)用：</p><p>　　廈門大學(xué)鄭天凌[11]等人對(duì)廈門市廈門大學(xué)附近海濱的海水利用發(fā)光菌檢測(cè)法進(jìn)行了取樣研究，不近對(duì)取樣的海域海水的水質(zhì)做出了科學(xué)的評(píng)價(jià)，而且還對(duì)發(fā)光菌檢測(cè)方法做了又意義的探索，發(fā)現(xiàn)鹽度對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度有明顯影響，過高

90、過低都會(huì)抑制其發(fā)光強(qiáng)度。</p><p>　　2．重金屬污染的毒性檢測(cè)應(yīng)用：</p><p>　　重金屬對(duì)發(fā)光菌的單一毒性及聯(lián)合毒性的研究，索常溫(25℃)下水中汞，鎘，銅和鋅對(duì)青?；【鶴67的急性毒性效應(yīng)[12]，選取OD600值1．75最佳發(fā)光狀態(tài)菌液以RS990l生物發(fā)光光度計(jì)為測(cè)試設(shè)備，按照第一部分研究建立的測(cè)試體系，測(cè)定水中汞，鎘，銅和鋅對(duì)發(fā)光菌半數(shù)發(fā)光抑制效應(yīng)濃度(Ec50)，

91、索常溫(25℃)下水中汞，鎘，銅和鋅對(duì)青?；【鶴67的急性毒性效應(yīng)，獲得4種毒物的EC50，按毒性由小到大順序?yàn)榕c對(duì)金魚進(jìn)行研究的結(jié)果相一致。</p><p>　　3．在檢測(cè)河流，湖泊沉積物或底泥的毒性[13]應(yīng)用：</p><p>　　劉愛菊，孔繁翔2006年報(bào)道，為了評(píng)估疏浚太湖五里湖的沉積物的生物毒性的影響，他們利用發(fā)光菌檢測(cè)法對(duì)五湖里的沉積物進(jìn)行急性毒性測(cè)驗(yàn)，比較了疏浚前后，沉積物

92、的毒性，并用淡水沉積物重金屬質(zhì)量基準(zhǔn)的結(jié)果做參比。他們得到，盡管疏浚可以有效削減沉積物中的重金屬污染物的總量，大不能顯著的消減其毒性</p><p>　　4．發(fā)光菌在檢測(cè)大氣污染應(yīng)用：</p><p>　　可以利用發(fā)光菌檢測(cè)大氣污染物很在就被認(rèn)識(shí)，吳自榮，章平等人報(bào)道了幾種人所共知的有害氣體對(duì)發(fā)光菌發(fā)光有抑制作用。但是其存在許多障礙，其中最主要的是怎樣精確定量氣體，并保證用語(yǔ)檢測(cè)的氣體有充

93、分的機(jī)會(huì)接觸到發(fā)光菌而產(chǎn)程作用，影響到發(fā)光細(xì)菌。即便如此，在方法上存在著明顯的不能精確定量的特點(diǎn)，但仍然可以說。應(yīng)用發(fā)光菌來快速評(píng)價(jià)大氣或工業(yè)廢氣的生物毒性是可行的發(fā)光細(xì)菌法檢測(cè)土壤中重金屬[14]方面：利用發(fā)光菌檢測(cè)土壤的污染狀況在國(guó)外已經(jīng)有大量的研究，但是在我國(guó)國(guó)內(nèi)關(guān)于這方面的研究比較少。但是由于發(fā)光菌法能很好地檢測(cè)出土壤中重金屬的生物有效毒性，且有毒物質(zhì)僅干擾發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光系統(tǒng)，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、成本低、檢測(cè)下限低等優(yōu)點(diǎn)，所以

94、利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度作為指標(biāo)來監(jiān)測(cè)有毒物質(zhì)，在國(guó)內(nèi)外越來越受到重視。我國(guó)于1995年將這一方法列為環(huán)境毒性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法(GB／r 15441．1995)。應(yīng)用明亮發(fā)光桿菌T3(Photobacterium Phosthoreum)對(duì)重金屬污染土壤的毒性進(jìn)行診斷，確定了實(shí)驗(yàn)室中采用人為定量投加污染物的情況下，土壤的最佳平衡時(shí)間為24h，最佳浸提時(shí)間為2h，最佳浸提劑為0</p><p>　　5．檢測(cè)工業(yè)固體廢棄

95、物的毒性應(yīng)用：</p><p>　　工礦企業(yè)在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的固體廢物，隨著生產(chǎn)的時(shí)序進(jìn)行而不斷增多，危害環(huán)境的惡果出現(xiàn)，因此對(duì)工礦企業(yè)廢棄物的處置日益受到關(guān)注，對(duì)其所造成的污染如何控制也是不容忽視的其中對(duì)生物毒性的檢測(cè)評(píng)估更是必須先行的工作，利用發(fā)光菌的機(jī)型毒性檢測(cè)方法對(duì)工業(yè)固體廢棄物進(jìn)行毒性檢測(cè)是很有效很方便的。1990年朱文杰和汪杰曾對(duì)此做過實(shí)驗(yàn)，得出采用固體廢棄物浸出液來反映其毒性是可行的，發(fā)光菌急性毒性

96、檢測(cè)方法具有足夠的靈敏度。謝思琴，顧宗濂報(bào)道了對(duì)幾種工業(yè)固體廢棄物用明亮發(fā)光桿菌凍干粉進(jìn)行急性毒性檢驗(yàn)。表明用發(fā)光菌檢測(cè)工業(yè)固體廢棄物的急性毒性事很可靠的，是可行的。此外，他們還對(duì)工業(yè)固體廢棄物經(jīng)處理后的毒性變化用發(fā)光菌進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，處理后毒性明顯降低，有的廢渣毒性已消除，有機(jī)物含量下降百分之四十至七十一，因此他們認(rèn)為，土地處理工業(yè)廢渣是一種和有效的處理方法。</p><p>　　6．食品保鮮包裝物毒性檢測(cè)

97、應(yīng)用：</p><p>　　2005年10月，我國(guó)國(guó)家之間總局對(duì)聚氯乙烯食品保鮮膜使用安全問題，通過對(duì)市場(chǎng)上存在的44種聚氯乙烯的食品保鮮膜進(jìn)行抽查，發(fā)現(xiàn)聚氯乙烯單體含有量合格的某些保鮮膜含有對(duì)人體有害的增塑劑，而此前這類產(chǎn)品常用語(yǔ)超市包裝新鮮水果，蔬菜。熟食等，由此，食品包裝膜的安全性引起了公共關(guān)注。有關(guān)于淡水發(fā)光菌Q67檢測(cè)毒性的論文早有發(fā)表，但是將其用于檢測(cè)人工高分子聚合物的毒性尚未見報(bào)道。有關(guān)人員通過淡水

98、發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試技術(shù)這一簡(jiǎn)單方法對(duì)市場(chǎng)上常見的食品保鮮包裝材料進(jìn)行生物毒性檢驗(yàn)?？捎枚拘詤⒈任锓宇悓?duì)發(fā)光菌的抑制情況與其樣品進(jìn)行比較。（苯酚類化合物在染料、炸藥、農(nóng)藥等生產(chǎn)中具有重要的地位，其取代酚是重要的化工原料或中間體，它們對(duì)人體具有潛在的致癌性，這些化合物大多屬于有毒有害物質(zhì)，在水體環(huán)境中廣泛存在，對(duì)水體生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖構(gòu)成危害，破壞了水體生態(tài)系統(tǒng)。取代酚類化合物對(duì)環(huán)境的污染一直被人們所關(guān)注，美國(guó)、日本等國(guó)家把取代酚類列入環(huán)

99、境中的重點(diǎn)污染物。Konemann指出：具有相似反應(yīng)機(jī)制的化合物，混合毒性可通過濃度的增加來確定，并提出了混合毒性指數(shù)（MTI），以此來評(píng)價(jià)多種化合物共存對(duì)水生生物的影響。</p><p>　　7．在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用：</p><p>　　豬，牛和奶牛內(nèi)等動(dòng)物在飼養(yǎng)時(shí)，可能會(huì)接觸到抗生素或某些獸藥，所用飼料，新鮮草料等也可能受到某些重金屬的污染物。隨著食物鏈的傳遞殘留在動(dòng)物體內(nèi)，人通過

100、使用便達(dá)到人體內(nèi)，固然會(huì)影響人的健康，鮮肉或牛奶及奶制品極有必要做有沒有污染毒性的檢驗(yàn)。華東師范大學(xué)熊蔚蔚[15]，朱文杰等人，以牛奶的安全檢測(cè)為例，做了一系列的研究。該設(shè)計(jì)方案考慮了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)循序的濃度對(duì)發(fā)光菌的毒性表現(xiàn)，注意到單一毒性和多種毒性共存的總毒性表現(xiàn)，客觀的正確判斷樣品的食品安全。得出以下結(jié)論:在蒸餾水和牛奶中重金屬對(duì)發(fā)光菌的毒性不同，且水溶液中重金屬的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于牛奶中重金屬的毒性。通過構(gòu)建牛奶安全性評(píng)價(jià)等級(jí)與30min徐

101、昂對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系，初步建立了發(fā)光菌牛奶實(shí)用安全性評(píng)價(jià)體系。</p><p>　　8．發(fā)光菌在其他方面的用途：</p><p>　　國(guó)內(nèi)朱金國(guó)等人利用明亮發(fā)光桿菌，采用大量接種快速培養(yǎng)方法，制備出適宜檢測(cè)用的發(fā)光菌檢測(cè)液，建立了發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)四環(huán)素族抗生紊效價(jià)結(jié)果表明，在該檢測(cè)體系條件下，明亮發(fā)光桿菌與金霉累、土霉素和四環(huán)素效價(jià)的抑制效應(yīng)呈良好的線性關(guān)系，菌液與抗生素的作用最佳體積配比為l：

102、3，相互作用的適宜時(shí)間為60至80min。該體系對(duì)四環(huán)素族抗生索的檢測(cè)靈敏度可達(dá)0．00625 5ug/ml， 比傳統(tǒng)的杯碟法高5倍，具有快速：簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可作為食品中抗生素殘留的一種快速、靈敏的篩選檢測(cè)方法。</p><p>　　A．Kahru．，K．Tomoson，T．Pall等人利用明亮發(fā)光桿菌凍千粉對(duì)廣泛使用的13種殺蟲劑、除草劑和14種溶劑，按，照，，Biotox進(jìn)行了測(cè)試，測(cè)試所得數(shù)據(jù)為5min的EC

103、ho值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毒性最大的殺蟲劑是五氯苯酚(EC50=55mg／1)，毒性最小的是百草枯EC50=14800lm/l，所得數(shù)據(jù)同Microtox 方法、動(dòng)物的半致死方法比較發(fā)現(xiàn)：Biotox方法與Microtox方法的農(nóng)藥與溶劑，農(nóng)藥，溶劑的相關(guān)性分別是0．78，0．37，0．95。同時(shí)。有些農(nóng)藥因?yàn)榧佑腥軇┑年P(guān)系會(huì)減弱農(nóng)藥的毒性，所以部分物質(zhì)的數(shù)據(jù)采用5min的EC20值。</p><p><b>　

104、　展望</b></p><p>　　隨著對(duì)污染控制的要求越來越高。十分需要開發(fā)一種低成本易于掌握的測(cè)試方法。發(fā)光細(xì)菌對(duì)于物質(zhì)毒性測(cè)試的高靈敏性通過許多的實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)，它優(yōu)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的長(zhǎng)周期和高成本，優(yōu)于化學(xué)方法的局限于某種或菜類物質(zhì)，可以測(cè)試出化合物的協(xié)同作用和拮抗作用，它的測(cè)試結(jié)果在報(bào)多方面都等同于化學(xué)物質(zhì)的綜合作用。因此作為廢水，土壤，空氣綜合毒物污染毒性，食品殘毒，藥品效價(jià)的評(píng)估等方面都有非常廣

105、泛和可靠的用途。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1]馬梅, 王子健. 利用主動(dòng)和被動(dòng)采樣技術(shù)和發(fā)光菌毒性測(cè)試評(píng)價(jià)水中有機(jī)污染物的毒性[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 24(4): 684-689.</p><p>　　[2]閻 鵬,孫 禮,李百祥.利用發(fā)光菌快速檢測(cè)環(huán)境污染物急性毒性的研究概況[J].

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