水稻莖葉優(yōu)勢表達(dá)基因OsZF153和OsW8513啟動(dòng)子的功能分析.pdf

1、啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵性的作用，它在很大程度上決定著目的基因表達(dá)的時(shí)間、空間和強(qiáng)度[1.2]。目前大規(guī)模商業(yè)化的植物基因工程產(chǎn)品中大多使用的是組成型啟動(dòng)子，它們能驅(qū)動(dòng)外源基因在植物的各種組織和所有發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)。這不僅增加了植株的代謝負(fù)擔(dān)，并造成物質(zhì)和能量上的巨大浪費(fèi)，往往還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育。因此，用特異性啟動(dòng)子取代組成型啟動(dòng)子，使外源基因能夠定時(shí)、定點(diǎn)、定量地在植物中表達(dá)，成為植物基因工程研究的重

2、要內(nèi)容。 水稻莖葉特異性啟動(dòng)子是指能驅(qū)動(dòng)內(nèi)源基因或外源基因在水稻莖和葉中表達(dá)，而不在種子食用部位表達(dá)的特殊啟動(dòng)子[3]。對這類啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用，不僅有助于闡釋相關(guān)基因的生物學(xué)功能，而且在基因工程中使用此類啟動(dòng)子將有助于消除人們對轉(zhuǎn)基因水稻食品安全性的擔(dān)心。本研究在前期得到的兩個(gè)水稻莖葉優(yōu)勢表達(dá)基因OsZF153和Os W8513啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上，對這兩個(gè)啟動(dòng)子分析進(jìn)行5'端或3'端分段缺失，尋找啟動(dòng)子的功能元件，進(jìn)一步分析啟動(dòng)子

3、的功能。 1、本實(shí)驗(yàn)根據(jù)啟動(dòng)子的順式作用元件的分布情況設(shè)計(jì)引物，對全長1938bp的Os ZF153啟動(dòng)子進(jìn)行5'端分段缺失，PCR擴(kuò)增獲得3條長度分別為494bp、810bp、1218bp的5'端缺失啟動(dòng)子，以及利用Os ZF153啟動(dòng)子上的HindIII單酶切位點(diǎn)酶切得到長度為1559bp的第四條5'端缺失啟動(dòng)子，依次命名為P153A、P153B、P153C和P153D。將上述4條缺失啟動(dòng)子分別連pMD18-T克隆載體，測序

4、正確后切下啟動(dòng)子，與含有g(shù)us基因和T-nos終止子的載體pDMC203(J4)相連，構(gòu)建具有“啟動(dòng)子-gus-Tnos”表達(dá)盒的中間載體。然后酶切下表達(dá)盒，與pCAMBIA1300載體相連，構(gòu)建啟動(dòng)子與gus基因相連的的融合表達(dá)載體pCZF153PA-GUS、pCZF153PB-GUS、pCZF153PC-GUS和pCZF153PD-GUS。 2、同樣根據(jù)啟動(dòng)子的順式作用元件的分布情況設(shè)計(jì)引物，對全長1971bp的Os W85

5、13啟動(dòng)子進(jìn)行5'端和3'端分段缺失，PCR擴(kuò)增獲得3條長度分別為728bp、1157bp、1549bp的5'端缺失啟動(dòng)子和長度分別為960bp、1197bp、1501bp的3'端缺失啟動(dòng)子，依次命名為P8513A、P8513B、P8513C和P8513D、P8513E、P8513F。同樣構(gòu)建啟動(dòng)子與gus基因相連的的融合表達(dá)載體pC8513PA-GUS、pC8513PB-GUS、pC8513PC-GUS、pC8513PD—GUS、pC

6、8513PE-GUS、pC8513PF-GUS。 3、將上述10條缺失啟動(dòng)子各自的表達(dá)載體以及本實(shí)驗(yàn)室先前已構(gòu)建好的Os ZF153全長啟動(dòng)子的表達(dá)載體pCZF153P-GUS和Os W8513全長啟動(dòng)子的表達(dá)載體pC8513P-GUS通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)分批轉(zhuǎn)化“日本晴”水稻愈傷，共轉(zhuǎn)化得到325個(gè)TO轉(zhuǎn)基因水稻植株克隆。其中有213個(gè)TO轉(zhuǎn)基因植株已成熟收種，112個(gè)TO轉(zhuǎn)基因植株目前尚處在分蘗期。213個(gè)TO轉(zhuǎn)基因克隆經(jīng)潮霉素檢

7、測共獲得136個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性克隆，其中轉(zhuǎn)Os ZF153系列啟動(dòng)子的有61個(gè)陽性克隆，轉(zhuǎn)Os W8513系列啟動(dòng)子的有75個(gè)陽性克隆。 4、對處于苗期、分蘗期和成熟期各個(gè)時(shí)期的TO轉(zhuǎn)基因陽性水稻植株的根、莖、葉、花、穎殼和種子各個(gè)器官分別進(jìn)行GUS活性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 對于Os ZF153啟動(dòng)子來說，gus基因在轉(zhuǎn)pCZF153PD-GUS(長度為1559bp的5'端缺失啟動(dòng)子)和pCZF153P-GUS(全長1938bp的啟動(dòng)

8、子)載體植株各個(gè)時(shí)期的根、莖、葉和穎殼中均能檢測到GUS活性，而種子中檢測不到GUS活性。且gus在轉(zhuǎn)PCZF153P-GUS載體植株的根、莖、葉和穎殼上強(qiáng)表達(dá)，而轉(zhuǎn)PCZF153PD-GUS載體植株GUS活性相對較弱。轉(zhuǎn)pCZF153P-GUS和PCZF153PD-GUS載體植株的花藥和花絲都可見gus有弱表達(dá)。而轉(zhuǎn)pCZF153PA-GUS、pCZF153PB-GUS和pCZF153PC-GUS(長度分別為494bp、810bp、1

9、218bp的5'端缺失啟動(dòng)子)載體植株各個(gè)時(shí)期各個(gè)器官均檢測不到GUS活性。 5、對于Os W8513啟動(dòng)子來說，gus基因在轉(zhuǎn)pC8513PA-GUS(長度為728bp的5'端缺失啟動(dòng)子)和pC8513P-GUS(全長1971bp的啟動(dòng)子)載體植株的根、莖、葉、穎殼、花藥和花絲上均能檢測到GUS活性，而種子中檢測不到GUS活性。且gus在轉(zhuǎn)pC8513P-GUS載體植株的根、莖、葉、穎殼、花藥和花絲上強(qiáng)表達(dá)，而轉(zhuǎn)pC8513P

10、A-GUS載體植株GUS活性相對較弱。轉(zhuǎn)pCZF153P-GUS和PCZF153PD-GUS載體植株的花藥和花絲都可見gus有弱表達(dá)。而轉(zhuǎn)pC8513PB-GUS、pC8513PC—GUS、pC8513PD-GUS、pC8513PE-GUS和pC8513PF-GUS(長度分別為1157bp、1549bp的2條5'端缺失啟動(dòng)子和960bp、1197bp、1501bp的3條5'端缺失啟動(dòng)子)載體植株的各個(gè)時(shí)期各個(gè)器官均檢測不到GUS活性。