臭氧和負(fù)離子對鐮刀菌m4抑制作用及其機(jī)理的初步研究

1、<p>　　臭氧和負(fù)離子對鐮刀菌M4抑制作用及其機(jī)理的初步研究</p><p>　　摘 要：為了探究臭氧和負(fù)離子對蓮藕采后主要腐敗菌-鐮刀菌M4的生長及細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的影響，本試驗對處于穩(wěn)定期的鐮刀菌M4分別進(jìn)行不同條件的臭氧和負(fù)離子處理，通過測定抑菌率、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性初步研究臭氧和負(fù)離子對鐮刀菌M4的抑制作用及其機(jī)理。結(jié)果顯示，臭氧、負(fù)離子對鐮刀菌M4均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率與處理時間成正相關(guān)

2、；臭氧和負(fù)離子之間具有協(xié)同作用；臭氧+負(fù)離子處理對鐮刀菌M4的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜均有顯著的破壞作用，破壞程度隨處理時間的延長而增加；處理前期主要是電解質(zhì)的滲出，處理2 h及以上時核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)開始滲出。 </p><p>　　關(guān)鍵詞：鐮刀菌M4；臭氧；負(fù)離子；抑菌率；細(xì)胞壁；細(xì)胞膜；通透性 </p><p>　　中圖分類號：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-3547（20

3、13）18-0098-04 </p><p>　　鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種重要的植物病原菌，主要為害小麥、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，造成嚴(yán)重的減產(chǎn)，其生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛分布于植物、土壤和水源中[1]。它屬于真菌的一種，具有細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。已有許多研究表明，鐮刀菌是農(nóng)作物生長、貯存過程中的主要為害菌種[2]。 </p><p>　　臭氧在常溫下是一種不穩(wěn)定的淡

4、藍(lán)色氣體，有特殊的刺激味。由于臭氧的強(qiáng)氧化性和廣譜性，因而具有消毒、殺菌、除臭、防霉、保鮮等功能[4]，其殺菌能力僅次于氟，是氯的3倍，殺菌速度極快，是氯的500～3 000倍[5]。一般認(rèn)為，臭氧殺滅細(xì)菌、霉菌類微生物是通過作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜構(gòu)成受到損害，導(dǎo)致新陳代謝障礙并抑制其生長，進(jìn)而繼續(xù)滲透破壞膜內(nèi)組織，直至細(xì)胞死亡[6]。又由于臭氧使用方便、刺激性小、作用快速、無殘留污染等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品保鮮與加工等領(lǐng)域[7]。 &

5、lt;/p><p>　　負(fù)離子是帶負(fù)電的原子或基團(tuán)[6]。氣體放電過程中產(chǎn)生的負(fù)離子具有較高的活性，且有很強(qiáng)的氧化還原作用，能破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜或細(xì)胞原生質(zhì)活性酶的活性，在果蔬保鮮中可以起到抗菌殺菌的目的[8]。同時，負(fù)離子還可以分解內(nèi)源乙烯，鈍化酶活性，降低呼吸強(qiáng)度，從而減緩營養(yǎng)物質(zhì)在貯藏期間的轉(zhuǎn)化。 </p><p>　　目前國內(nèi)對臭氧和負(fù)離子的研究多集中于應(yīng)用保鮮方面，對其抑菌機(jī)理報道較少

6、。本試驗通過測定抑菌率、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性變化，對臭氧、負(fù)離子抑制鐮刀菌M4的作用及其機(jī)理做了初步探究。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p><b>　　1.1 試驗材料 </b></p><p>　　①菌種 鐮刀菌（Fusarium oxysporum）M4由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)

7、學(xué)院分離保存。 </p><p>　　②試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。 </p><p>　?、蹆x器設(shè)備 MIC-03臭氧變送器由深圳市藍(lán)月測控技術(shù)有限公司生產(chǎn)；XA-1負(fù)離子發(fā)生器、DDS-11A電導(dǎo)率儀由上海雷磁儀器廠生產(chǎn)；722N 分光光度計由上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；J-E超速冷凍離心機(jī)由美國Beckman Coulter Inc生產(chǎn)。

8、</p><p><b>　　1.2 試驗方法 </b></p><p>　?、僖志实臏y定 將鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后，在菌落邊緣打出直徑6 mm的菌餅，移至PDA平板中央，然后將打開蓋子的平板立即放入密閉有機(jī)玻璃箱中進(jìn)行以下處理（溫度25℃，濕度50%）：A.臭氧（3 500 mg/m3）、B.負(fù)離子（106 ions/cm3）、C.臭氧+負(fù)離子（臭氧3

9、 500 mg/m3+106 ions/cm3），分別處理1，2，3，4 h。每個處理重復(fù)3皿，置于25℃下培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測定其菌落擴(kuò)展直徑，并計算抑菌率。以不做任何處理的培養(yǎng)基為對照。用抑菌率表示其對鐮刀菌M4的抑制效果。 </p><p>　　抑菌率（%）=[（對照菌落的平均直徑-處理菌落的平均直徑）/對照菌落的平均直徑]×100% </p><p>　?、趯w細(xì)

10、胞壁的影響 選取C處理的菌餅于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)3 d后的菌液，同時不做處理的作為對照組，4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液用分光光度計于510 nm處測定吸光值[9]。 </p><p>　?、蹖w細(xì)胞膜通透性的影響 a.對電導(dǎo)率的影響。選取C處理的菌餅于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)3 d后的菌液，同時以不做處理組作為對照，4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液用

11、電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，確定金屬離子的滲出變化趨勢[10]。 </p><p>　　b.對大分子內(nèi)含物滲出的影響。選取C處理的菌餅于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)3 d后的菌液，同時以不做處理組作為對照，置于超速冷凍離心機(jī)中4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液分別于260 nm和280 nm處測定吸光值[11] 。 </p><p><b>　　2 結(jié)果與分析 <

12、;/b></p><p>　　2.1 不同處理條件對鐮刀菌的抑制作用 </p><p>　　從圖1可知，在臭氧（3 500 mg/m3）、負(fù)離子（106 ions/cm3）、臭氧+負(fù)離子（臭氧3 500 mg/m3+ </p><p>　　106 ions/cm3）3種不同處理條件下，抑菌率與處理時間均呈正相關(guān)，處理時間越長，抑菌效果越好；且臭氧+負(fù)離子處理的

13、抑菌效果均優(yōu)于臭氧、負(fù)離子單獨處理，說明臭氧和負(fù)離子處理之間具有協(xié)同作用，這對于提高鐮刀菌生長抑制率具有重要意義。方差分析顯示，同一處理時間，3種處理間差異極顯著（p<0.01），每種處理中不同處理時間差異極顯著（p<0.01）。 </p><p>　　2.2 臭氧+負(fù)離子對菌體細(xì)胞壁通透性的影響 </p><p>　　堿性磷酸酶位于細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的間隙之中，在正常情況下

14、不向外分泌，只有當(dāng)細(xì)胞壁的通透性增大后，堿性磷酸酶才會釋放到細(xì)胞體外[10]。由圖2結(jié)合顯著性分析可知，處理組與對照組相比，堿性磷酸酶的溶出量顯著增加（p 　　2.3 臭氧+負(fù)離子處理對細(xì)胞膜通透性的影響 </p><p>　?、俪粞?負(fù)離子處理對電導(dǎo)率的影響 由圖3可知，處理組鐮刀菌M4培養(yǎng)液的電導(dǎo)率顯著高于對照組（p<0.05），且隨著處理時間的延長，電導(dǎo)率增大，兩兩之間具有顯著差異（p<0.0

15、5），說明臭氧+負(fù)離子處理的菌體細(xì)胞隨著作用時間的延長，電解質(zhì)的滲出量不斷增大，細(xì)胞膜被破壞。 </p><p>　?、诔粞?負(fù)離子處理對大分子內(nèi)含物滲出的影響 細(xì)胞膜的通透性是反映細(xì)胞膜完整性的一部分，當(dāng)真菌細(xì)胞膜被破壞后，細(xì)胞內(nèi)的小分子物質(zhì)首先外泄出來，接著是大分子物質(zhì)如核酸和蛋白質(zhì)[2]。為進(jìn)一步反映臭氧+負(fù)離子處理對細(xì)胞膜完整性的影響，可以測定滲透到細(xì)胞外的核酸和蛋白質(zhì)的含量。核酸、蛋白質(zhì)分別在 260

16、nm、280 nm 處有最大吸收峰，對260 nm和280 nm吸收物質(zhì)的檢測被廣泛應(yīng)用于測定細(xì)胞膜的完整性[12]。 </p><p>　　由圖4結(jié)合顯著性分析可知，與對照組相比，臭氧+負(fù)離子處理1 h，細(xì)胞外液核酸和蛋白質(zhì)的含量沒有顯著變化（p>0.05）；臭氧+負(fù)離子處理2 h及以上組細(xì)胞外液核酸和蛋白質(zhì)的含量顯著增加（p<0.05），且隨著時間的延長，吸光值數(shù)值增大，處理 </p>

17、<p>　　2 h及以上組細(xì)胞外液核酸和蛋白質(zhì)的含量隨時間延長均有顯著差異（p<0.05），尤其在處理3 h后差異顯著增大。由此說明，臭氧+負(fù)離子處理逐步導(dǎo)致鐮刀菌M4大分子內(nèi)含物滲出，且隨處理時間延長，這種效應(yīng)逐漸增大。 </p><p>　　綜合圖3和4分析可知，臭氧+負(fù)離子處理對鐮刀菌M4的細(xì)胞膜有顯著的破壞作用，破壞程度隨處理時間的延長而增加，處理前1 h主要導(dǎo)致小分子電解質(zhì)滲出，致使

18、細(xì)胞外液電導(dǎo)率顯著增加，當(dāng)處理時間延長至2 h及以上時，核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)才透過細(xì)胞膜，滲透到菌體外，處理3 h后核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)開始快速滲出。 </p><p><b>　　3 結(jié)論與討論 </b></p><p>　　本試驗初步研究了臭氧、負(fù)離子對鐮刀菌M4的抑菌作用及其機(jī)理，結(jié)果表明臭氧、負(fù)離子對蓮藕采后病原菌鐮刀菌M4均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率與

19、處理時間呈正相關(guān)；臭氧和負(fù)離子之間具有協(xié)同作用；臭氧+負(fù)離子處理對鐮刀菌M4的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜均有顯著的破壞作用，破壞程度隨處理時間的延長而增加；處理前期主要是電解質(zhì)的滲出，處理2 h及以上時核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)開始滲出?？赡苷浅粞?負(fù)離子處理對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的這種逐步破壞，導(dǎo)致其通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，影響菌體新陳代謝和生命活動，從而達(dá)到對鐮刀菌M4的抑制效果。 </p><p><b>　　

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