稻瘟病菌菌株FJ81278無毒基因Avr-Pid2的定位及深度測序分析.pdf

1、稻瘟病是世界水稻生產(chǎn)上的重要病害之一，嚴(yán)重影響各國的糧食安全。培育抗病品種是防治該病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施，但往往由于稻瘟病菌無毒基因發(fā)生變化的菌株在群體中占優(yōu)勢，導(dǎo)致病菌群體能夠使相對應(yīng)的抗性基因在田間喪失作用。稻瘟病菌與水稻的互作符合“基因?qū)颉标P(guān)系，因此，對稻瘟病菌無毒基因的研究不僅有助于揭示稻瘟病菌的致病機(jī)理，而且有助于闡明水稻和稻瘟病菌的互作和進(jìn)化機(jī)制，為水稻抗病品種布局與利用提供重要信息。
　　 為克隆Avr-Pid2

2、，用菌株GUY11和FJ81278及其有性后代群體對水稻品種Pi-d2及其親本TP309進(jìn)行毒性分析，結(jié)果表明：菌株FJ81278對Pi-d2無毒，推測含Avr-Pid2；GUY11和FJ81278的有性后代在Pi-d2上的無毒、有毒分離比例符合1:1，推斷FJ81278對Pi-d2的無毒性由單一基因座控制。通過SSR標(biāo)記和轉(zhuǎn)座子元件標(biāo)記分析，獲得了與無毒基因Avr-Pid2連鎖的標(biāo)記Propiz-t和ms7-27/28，它們與Avr-

3、Pid2的遺傳距離分別為6.1 cM、13.0 cM。這些標(biāo)記的獲得將Avr-Pid2限制在染色體上大約420kb的物理距離范圍內(nèi)，為下一步的精細(xì)定位及克隆奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 進(jìn)一步采用深度測序?qū)闒J81278進(jìn)行基因組和轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示，菌株FJ81278基因組中預(yù)測基因10483個(gè)，通過和GUY11基因組比較，獲得FJ81278中特異的基因678個(gè)，其中編碼含有信號肽蛋白的基因161個(gè)。轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果表明，與

4、稻瘟病菌70-15數(shù)據(jù)庫比對，得到9759條已有注釋的轉(zhuǎn)錄本，未注釋的新轉(zhuǎn)錄本3706條，占總數(shù)的37.9％；基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化有5’端延長和3’端延長；發(fā)現(xiàn)可變剪切基因1464個(gè)，占基因總數(shù)的13.0％左右，內(nèi)含子保留是主要的可變剪接模式；此外還分析出2470個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNP)位點(diǎn)、1007個(gè)插入或缺失多態(tài)性(InDel)位點(diǎn)。以AgriGO分析有表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本結(jié)果顯示，分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞組分3大類被劃分為更詳細(xì)的31個(gè)小的類別

5、，分類結(jié)果顯示了稻瘟病菌發(fā)育各階段基因表達(dá)譜的總體情況。分析轉(zhuǎn)錄豐度較低的基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄豐度較低的基因多是與互作、應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的基因。通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了菌株FJ81278批量特異基因及其表達(dá)情況，為我們研究稻瘟病菌基因表達(dá)的組織特異性和表達(dá)水平、致病機(jī)制、物種進(jìn)化和互作機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。
　　 已克隆的稻瘟病菌無毒基因多為小的、無同源性的分泌蛋白，因此我們初步把21個(gè)編碼蛋白含信號肽(<300aa)的特異基因作為菌株

6、FJ81278中無毒基因的候選基因，通過酵母同源重組進(jìn)行過表達(dá)分析，并在福建田間菌株中做關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，大部分的過表達(dá)轉(zhuǎn)化子對含有抗性基因的水稻的致病性與野生型菌株相同，未發(fā)生毒性變化；對致病性發(fā)生變化的需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證；所研究的特異基因在田間菌株中的擴(kuò)增結(jié)果表明，分子擴(kuò)增的多態(tài)性與表型無明顯相關(guān)，需要用更多的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的田間菌株對更多的特異基因做關(guān)聯(lián)分析。
　　 21個(gè)預(yù)測含有信號肽的特異基因多無保守結(jié)構(gòu)域，而MoU

7、ng5編碼的蛋白MoHsbA預(yù)測含有疏水表面結(jié)合蛋白A(HsbA)結(jié)構(gòu)域，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析，結(jié)果表明，該假定編碼的蛋白含有信號肽剪切位點(diǎn)，是疏水性蛋白。通過qRT-PCR分析該基因在菌絲、孢子、附著胞階段的表達(dá)，結(jié)果表明該基因在各階段都有表達(dá)，但表達(dá)量不同，在附著胞階段相對表達(dá)水平較高，約是菌絲階段表達(dá)量的1.3倍，在孢子階段相對表達(dá)量較低。推測MoHsbA可能與稻瘟病菌附著胞的發(fā)育過程密切相關(guān)。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示Hs