稻瘟病菌的組學(xué)分析和致病相關(guān)基因的挖掘及功能研究.pdf

1、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是水稻生產(chǎn)上最具破壞性的病原菌之一，它引起的稻瘟病嚴(yán)重威脅著全球水稻的生產(chǎn)安全。目前，抗病品種和化學(xué)藥劑是控制該病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，但是，由于該病原菌易變，新的致病和抗藥性群體的產(chǎn)生容易導(dǎo)致選育的抗病品種和藥劑失去利用價(jià)值。因此，稻瘟病的防治始終是水稻生產(chǎn)上的一個(gè)重要難題，而對(duì)該病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育及致病分子調(diào)控機(jī)制的研究是控制該病害的重要前提。而且，近年來(lái)水稻和稻瘟病菌全基因組測(cè)序工作的完成

2、使兩者組成了具有理論研究?jī)r(jià)值的植物-病原菌互作模式系統(tǒng)。本文系統(tǒng)地研究了稻瘟病菌菌株98-06基因組水平的變異特點(diǎn)、其與水稻互作的轉(zhuǎn)錄模式和非保守基因組區(qū)域的基因功能，并在此基礎(chǔ)上篩選出133個(gè)候選無(wú)毒基因，同時(shí)鑒定了3個(gè)稻瘟病菌效應(yīng)分子，研究結(jié)果有助于理解稻瘟病菌的進(jìn)化機(jī)制，對(duì)無(wú)毒效應(yīng)分子的挖掘有參考價(jià)值。研究結(jié)果如下:
　　稻瘟病菌菌株98-06的全基因組序列分析。選取了一個(gè)在田間表現(xiàn)高毒力并推測(cè)含有12個(gè)已知無(wú)毒基因的稻瘟病

3、菌株98-06進(jìn)行全基因組測(cè)序，并與已公布的菌株70-15、P131、Y34進(jìn)行比較分析。利用全基因組鳥(niǎo)槍法(WGS)建Paired-End片段庫(kù)進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序后得到了98-06的原始序列，總覆蓋率達(dá)到135倍，遠(yuǎn)高于其它已測(cè)序菌株，從而獲得拼接質(zhì)量較高的基因組序列。將98-06與參考實(shí)驗(yàn)室菌株70-15進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，有1.5 Mb菌株特有序列和249個(gè)菌株特異基因，這些序列和基因分散位于整個(gè)基因組中，并且傾向于分布在染

4、色體的兩端，提示這些基因在菌株的基因組進(jìn)化過(guò)程中可能具有重要的作用。同時(shí)，對(duì)98-06基因組序列進(jìn)行了基因預(yù)測(cè)、基因家族分析、重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子分析。進(jìn)一步對(duì)目前報(bào)道的15個(gè)稻瘟病菌效應(yīng)分子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度小于200 aa和半胱氨酸含量較高外泌蛋白可作為候選的效應(yīng)分子，根據(jù)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)從98-06基因組的1，732個(gè)外泌蛋白中篩選得到645個(gè)候選效應(yīng)分子。
　　98-06菌株和水稻互作轉(zhuǎn)錄組分析。在對(duì)98-06菌株進(jìn)行全基因

5、組序列分析的基礎(chǔ)上，我們利用高通量的RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)菌株98-06與水稻親和互作的不同階段（包括菌絲階段、孢子階段、侵染8小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。RNA測(cè)序產(chǎn)生的大量reads分別與稻瘟菌、水稻的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，共獲得11，078個(gè)稻瘟菌和26，452個(gè)水稻的基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)。在轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的基因表達(dá)結(jié)果中，篩選出樣品間差異表達(dá)的基因。通過(guò)對(duì)已報(bào)道的63個(gè)致病相關(guān)基因和10個(gè)效應(yīng)分子進(jìn)行基因表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)了

6、關(guān)鍵的致病相關(guān)基因和效應(yīng)分子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄模式，致病相關(guān)轉(zhuǎn)錄模式表現(xiàn)為侵染8小時(shí)至24小時(shí)下調(diào)表達(dá)，而24小時(shí)至72小時(shí)又呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì);效應(yīng)分子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄模式表現(xiàn)為菌絲和孢子階段表達(dá)量很低，而在侵染階段高量上調(diào)表達(dá)。這一結(jié)果提示，這兩種轉(zhuǎn)錄模式可用來(lái)預(yù)測(cè)新的致病相關(guān)基因和效應(yīng)分子。差異表達(dá)基因以及水稻中SA、JA、ET信號(hào)通路的分析都表明，在稻瘟菌-水稻互作過(guò)程中大量的基因受到調(diào)控上升表達(dá)，兩者之間存在激烈的“戰(zhàn)爭(zhēng)”。進(jìn)一步根據(jù)已克隆的A

7、vr-Pik/km/kp和Avr-Pizt轉(zhuǎn)錄特征從預(yù)測(cè)的645個(gè)候選效應(yīng)分子中篩選出具有相似轉(zhuǎn)錄模式的133個(gè)候選的無(wú)毒效應(yīng)分子，對(duì)其中的15個(gè)98-06菌株特有的編碼外泌蛋白的基因采取CAST分析預(yù)測(cè)到6個(gè)新的效應(yīng)分子。
　　三個(gè)候選效應(yīng)分子和兩個(gè)98-06特有基因功能分析。前面對(duì)稻瘟病菌98-06基因組和互作轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，本部分進(jìn)一步對(duì)候選的效應(yīng)分子及菌株特異基因進(jìn)行功能研究。候選效應(yīng)因子PEX6和PEX9是98-06菌

8、株特有基因，PEX12預(yù)測(cè)含有核定位信號(hào)，PEX17和PEX18是98-06菌株特有基因、SMART預(yù)測(cè)有功能域的兩個(gè)非編碼外泌蛋白基因。3個(gè)候選效應(yīng)分子均在侵染階段顯著上調(diào)表達(dá)，PEX17、EX18在不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平變化不大。對(duì)5個(gè)基因在42個(gè)菌株中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示它們具有有/無(wú)的多態(tài)性。將這5個(gè)98-06菌株特異基因進(jìn)行基因敲除的功能研究表明，有的菌株特異基因參與了稻瘟病菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢或致病過(guò)程。對(duì)候選效應(yīng)分子進(jìn)行GFP熒

9、光定位觀(guān)察，Pex6、Pex9、Pex12聚集在稻瘟菌特異的外泌結(jié)構(gòu)——BIC（biotrophic interfacial complex）中。Pex6、Pex9、Pex12在煙草中表達(dá)能夠抑制BAX引起的壞死，且Pex12定位在煙草的細(xì)胞核中。進(jìn)一步將PEX6、PEX9、EX12在自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下導(dǎo)入Guy11中，在含有單抗病基因的水稻品種上進(jìn)行致病性測(cè)驗(yàn)，排除了它們是無(wú)毒基鼠Avr-Pikh、Avr-Piz5、Avr-Pish、A

10、vr-Pi1、Avr-Pi7、Avr-Pi20和Avr-Pita2的可能性。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PEX12作為效應(yīng)分子導(dǎo)入Guy11菌株中表達(dá)后，使Guy11在含單抗病基因Pib水稻品種K14上，由抗病變成感病，在分別含單抗病基因Pi11、Pi12的水稻品種K30、K23上由中等抗病轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨雀胁?。推測(cè)Pex12可能具有抑制ETI（Effectors Triggered Immunity）并促進(jìn)病斑擴(kuò)展的重要作用。Pex12效應(yīng)分子能夠抑制水稻中

11、ETI在稻瘟病菌效應(yīng)分子的研究中尚屬首例。Pib、Pi12、Pi11抗病品種在田間的抗譜窄，而對(duì)PEX12的多態(tài)性分析顯示，Pex12效應(yīng)分子在田間廣泛存在，因此推測(cè)Pex12可能是導(dǎo)致這3個(gè)抗病品種“失效”的原因。將來(lái)對(duì)Pex12抑制ETI的分子機(jī)制的解釋將有助于稻瘟病菌和水稻的互作致病機(jī)制，Pex12可望為新型抗稻瘟病藥劑提供靶標(biāo)。
　　此外，還對(duì)稻瘟病菌的轉(zhuǎn)錄因子MYB1進(jìn)行了深入的功能研究，有助于更好的了解絲狀真菌中MYB

12、類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子所起的作用。
　　綜上所述，本研究系統(tǒng)深入地對(duì)稻瘟病菌田間菌株98-06的全基因組和互作轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)98-06與參考菌株70-15的全基因組序列相比具有1.55 Mb的菌株特有序列，這些序列傾向于分布在靠近染色體兩端，可能與基因組進(jìn)化以及菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)菌株不同階段的轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵的致病相關(guān)轉(zhuǎn)錄模式，并根據(jù)已鑒定的效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄模式篩選出候選的效應(yīng)分子，對(duì)菌株特異效應(yīng)分子Pex6、Pex9、P