藍(lán)耳病毒RX株的分離鑒定和中藥體外抗病毒的作用研究.pdf

1、本研究通過(guò)設(shè)計(jì)PRRSV PCR特異性引物，利用RT-PCR方法對(duì)廣東地區(qū)某疑似暴發(fā)PRRS的豬場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為PRRSV陽(yáng)性。然后用Marc-145細(xì)胞對(duì)發(fā)病豬肺臟、淋巴結(jié)進(jìn)行病毒分離。從肺臟中分離得到一株病毒命名為PRRSV RX株。試驗(yàn)對(duì)分離病毒進(jìn)行了鑒定，電鏡觀察結(jié)果可見(jiàn)胞漿內(nèi)散布大量呈球形的病毒粒子，直徑為40-60nm；病毒的TCID50為10-4.5/0.1 ml。病毒為RNA病毒；RX株經(jīng)56℃處理20-30min后喪

2、失對(duì)細(xì)胞的感染力；病毒培養(yǎng)的最佳PH值是6.8-7.0。病毒動(dòng)物回歸試驗(yàn)表明，分離病毒接種40日齡的仔豬，臨床表現(xiàn)體溫升高和一定程度的呼吸癥狀。 選用黃芪、板藍(lán)根、甘草、魚(yú)腥草、山楂和青蒿六種中草藥和為試驗(yàn)藥物進(jìn)行體外抗病毒試驗(yàn)。中草藥采用傳統(tǒng)的水煮浸提法分別提取并濃縮成100mg/ml溶液作為原液，高壓滅菌處理備用。藥物原液倍比稀釋成不同濃度以測(cè)定其對(duì)Marc145細(xì)胞的毒性作用，來(lái)確定藥物的安全濃度。以安全濃度為準(zhǔn)，稀釋成四

3、個(gè)不同濃度在Marc145細(xì)胞上做抗病毒試驗(yàn)；采用三種作用方式：先加藥物后加病毒，先加病毒后加藥物，藥物與病毒先作用一段時(shí)間后加入，以CPE、病毒滴度和MTT法測(cè)得的OD值為觀測(cè)指標(biāo)評(píng)價(jià)藥物抗PRRSV病毒的活性，以探討其抗病毒吸附、抗病毒復(fù)制或直接滅活病毒的作用方式。試驗(yàn)結(jié)果如下： 各藥物對(duì)Marc145細(xì)胞的安全濃度分別為黃芪12.5 mg/mL、板藍(lán)根3.125 mg/mL、甘草3.125 mg/mL、山楂3.125 mg

4、/mL、魚(yú)腥草1.526 mg/mL、青蒿1.526 mg/mL。 所篩選藥物黃芪，板藍(lán)根，甘草，山楂，魚(yú)腥草，青蒿都具有抗病毒吸附作用而且保護(hù)作用均顯著；先加病毒后加藥物時(shí)，魚(yú)腥草的作用比較穩(wěn)定而板藍(lán)根在3.125 mg/mL，1.562 mg/mL保護(hù)率最高。藥物對(duì)病毒的殺滅作用時(shí)板藍(lán)根在3.125 mg/mL，1.562 mg/mL的作用比較明顯。不同藥物對(duì)同種細(xì)胞的毒性不一樣。 綜合三種加藥方式的效果考慮，板藍(lán)根