豬肝臟特異性TTR基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)扣囊篩膜孢酵母菌BGL1基因在轉(zhuǎn)基因鼠中的表達(dá)驗(yàn)證.pdf

1、本論文在活體水平驗(yàn)證豬肝臟組織特異性TTR基因啟動(dòng)子的活性及組織特異性。本研究構(gòu)建由豬肝臟特異性TTR基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BGL1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)RT-PCR、Western Blot等技術(shù)研究TTR基因啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因BGL1表達(dá)及β-葡萄糖苷酶的活性。主要研究成果如下:
　　1.通過(guò)原核顯微注射技術(shù)共得到4只轉(zhuǎn)基因首建鼠，其中3只雄性鼠(A、B、C)，1只雌性鼠(D)。對(duì)獲得的4只首建鼠分別建系進(jìn)行研究，最終B首建鼠

2、建系成功，共獲得5代能穩(wěn)定遺傳外源基因的轉(zhuǎn)基因仔鼠，F(xiàn)5代陽(yáng)性率達(dá)到90％以上;從F0-F3代外源基因拷貝數(shù)在逐漸增加，F(xiàn)3代拷貝數(shù)達(dá)112.56。
　　2.RT-PCR檢測(cè)TTR基因啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)BGL1基因表達(dá)，并且經(jīng)Western Blot證實(shí)能夠在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠的肝臟組織中表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)，而其余組織（心臟、脾臟、肺、腎臟、腸、肌肉、脂肪）均沒(méi)有表達(dá)。
　　3.利用β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，β-GC)

3、活性測(cè)定試劑盒分別測(cè)定轉(zhuǎn)基因鼠與野生型鼠肝臟組織中的β-葡萄糖苷酶活性，結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中的β-葡萄糖苷酶活力顯著高于野生型小鼠。
　　4.分別測(cè)定轉(zhuǎn)基因鼠與野生型鼠肝臟重量指數(shù)（liver weight index，LWI），對(duì)肝臟組織切片進(jìn)行HE染色分析和EVG染色分析、生長(zhǎng)曲線分析，結(jié)果表明:外源基因的表達(dá)并未引起轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織的病變，沒(méi)有對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠個(gè)體造成不良影響。
　　5.成功制備抗扣囊復(fù)膜孢酵母菌β