DAZ基因家族DAZL-BOULE與犏牛雄性不育關(guān)系的研究.pdf

1、牦牛是牛屬動物中唯一能適應(yīng)高寒氣候環(huán)境而延續(xù)至今的牛種，屬珍稀畜種資源和生產(chǎn)性能低的原始牛種，也是世界屋脊的“景觀牛種”.為了提高其生產(chǎn)性能，人們一直利用普通牛同牦牛進行種間雜交，獲得具有明顯雜種優(yōu)勢的一代雜種犏牛。但由于犏牛雄性不育，種間雜交不能達到改良牦牛遺傳本質(zhì)和充分利用牦牛遺傳資源的目的，雜種優(yōu)勢的利用和新型牛種的培育均受到了極大的限制，成為牦牛雜交改良的“攔路虎”。近幾十年來，為探討犏牛雄性不育的問題，國內(nèi)外許多學(xué)者對犏牛雄性

2、不育這一復(fù)雜的生物現(xiàn)象坐了很多有意義的研究和探討，但至今尚未找到犏牛雄性不育的主導(dǎo)原因。DAZ基因家族包括DAZ(Deleted in Azoospermia)、DAZL(DAZ-like)和BOULE基因，是精子生成的重要調(diào)控因子。DAZL起源于BOULE基因，位于人類2號染色體，BOULE位于人類的3號染色體上，是DAZ基因家族的祖先基因。
　　 為了探討犏牛雄性不育問題，本研究以成年健康雄性黃牛、牦牛和犏牛為研究對象，運用

3、組織切片、RT-PCR克隆測序、Real-time PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)以及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和系統(tǒng)發(fā)育分析對DAZL和BOULE基因的組織表達、在睪丸組織中的表達差異水平分析，和BOULE基因在黃牛精子發(fā)生中的組織定位，為研究犏牛雄性不育與DAZ基因家族的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。
　　 1.牦牛、犏牛DAZL基因的克隆、序列分析及表達的研究
　　 本試驗根據(jù)黃牛DAZL基因序列EF501823設(shè)計引物擴增出牦牛和犏牛全長分別為

4、1772bp、1778bp的序列，兩段序列包含完整的ORF編碼區(qū)，全長為885bp，編碼295個氨基酸。生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃牛編碼區(qū)序列與牦牛和犏牛分別為同源性分別為99.43％、98.31％，與其他動物也具有較高的同源性。含有DAZ家族所具有的典型的RRM結(jié)構(gòu)域、DAZ重復(fù)基序，同時在N端還具有高度保守的PABP作用位點和Pumilio-2作用位點，說明脊椎動物的DAZL基因在進化上是高度保守的。系統(tǒng)發(fā)育樹分析，聚類結(jié)果與經(jīng)典分類學(xué)

5、結(jié)果基本一致，實時熒光定量PCR顯示，DAZL在三種牛睪丸組織中的表達量中，黃牛與牦牛差異顯著(P＜0.05)，黃牛與犏牛，犏牛與牦牛差異不顯著(P＞0.05)。推測DAZL基因與犏牛雄性不育無關(guān)。
　　 2.牦牛、犏牛BOULE基因的克隆、序列分析及表達的研究
　　 本試驗根據(jù)黃牛BOULE基因序列(NM_001102115)設(shè)計引物擴增出牦牛和犏牛的全長分別為1647bp、1650bp，該序列包含完整的編碼區(qū)，二者也

6、都含有885bp的相同的完整開放閱讀框(ORF)，編碼一個295個氨基酸蛋白，進行同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牦牛、犏牛和黃牛BOULE基因編碼區(qū)核苷酸序列的同源性為99.85％，氨基酸序列的同源性為98.31％，在編碼區(qū)內(nèi)，三個物種共發(fā)現(xiàn)了4處堿基差異(0.45/100bp)，與其他動物也具有較高的同源性，也含有DAZ基因家族所具有的典型的RRM結(jié)構(gòu)域、DAZ重復(fù)基序。系統(tǒng)發(fā)育分析與經(jīng)典分類結(jié)果也基本一致。實時熒光定量PCR顯示，BOULE基

7、因在三種牛睪丸組織中的表達量中，黃牛與牦牛差異不顯著(P＞0.05)，黃牛、牦牛，與犏牛差異顯著(P＜0.05)。推測BOULE基因與犏牛雄性不育有一定的關(guān)系。
　　 3.黃牛、牦牛、犏牛睪丸組織學(xué)觀察和BOULE m RNA在睪丸組織的表達研究
　　 制作黃牛、牦牛和犏牛睪丸組織的的石蠟切片并HE染色發(fā)現(xiàn)，黃牛睪丸組織生精小管發(fā)育正常，可見各級生精細胞，內(nèi)有不同時期大量的生精細胞，間質(zhì)組織和生精小管無間隙小或間隙小，而

8、牦牛睪丸組織生精小管也發(fā)育正常，可見各級生精細胞，犏牛睪丸組織生精小管官腔大小及形態(tài)不一致，管壁皺縮，生精小管上皮多由1～2層精原細胞構(gòu)成，有些精原細胞已經(jīng)死亡，初級精母細胞很少，無次級精母細胞犏牛生精小管由1～2層精原細胞構(gòu)成，精母細胞少，間質(zhì)組織與基底膜間隙寬，由組織液填充。原位雜交結(jié)果顯示，BOULE基因主要分布在初級精母細胞和次級精母細胞中，在其余各級細胞中未發(fā)現(xiàn)其表達，推測犏牛精子發(fā)生失敗，生精細胞凋亡等表象可能與BOULE基