大黃魚頭腎SSH cDNA文庫構建及兩個重要生理功能分子(BPI、DP1)的生物學特征和功能研究.pdf

1、大黃魚是我國近海特有的主要經(jīng)濟魚類和當前最主要海水養(yǎng)殖魚類之一，目前關于大黃魚的基礎免疫學和生理學方面的研究還比較少。為了獲得涉及大黃魚的基礎免疫學和生理學方面的重要的差異表達基因，本研究以肽聚糖為免疫刺激劑，用抑制性差減雜交技術(SSH)構建了大黃魚受肽聚糖刺激后頭腎差異表達基因的cDNA文庫，并結合RACE-PCR技術對其中2個重要生理功能的分子(BPI、DP1)進行了克隆鑒定及生物學特征和功能研究。本研究取得的主要結果包括3個方面

2、：
　　 1 cDNA文庫分析結果
　　 在構建好的cDNA文庫中，隨機挑取克隆測序得到196個EST，組裝后得到149個unique gene, GenBank編號為EB643250-EB643371和GO271613-GO271637，其中26個有明確的注釋，根據(jù)其功能和作用可以被分為10類，其中5個與免疫反應相關，3個線粒體基因，3個信號轉(zhuǎn)導分子，5個蛋白激酶類分子，2個癌基因，2個微衛(wèi)星基因，2個細胞骨架基因，1

3、個RNA水平相關因子，1個雄性不育基因和1個核糖核蛋白。2大黃魚殺菌通透增強蛋白Pc-BPI的生物學特征和功能研究
　　 該基因cDNA全長為1919 bp（GenBank序列號：DQ917778），開放閱讀框長1419 bp，編碼472個氨基酸。大黃魚Pc-BPI的氨基酸序列與其他物種的同源物的相似性為25-36％。在Pc-BPI的N末端(5.02e-31)和C末端(1.93e-32)分別包含一個典型的哺乳動物BPI/LBP/

4、CETP的結構域。
　　 Pc-BPI在正常大黃魚各組織中為普遍性表達，在鰓、脾、頭腎中的表達量比其它被檢組織表達高，其表達水平可被福爾馬林滅活的諾卡氏菌(FI-Ns)和福爾馬林滅活的溶藻弧菌(FI-Va)誘導。
　　 表達了大黃魚Pc-BPI基因的N末端和C末端的原核重組蛋白(rBN、rBC)，和Pc-BPI全蛋白的真核表達產(chǎn)物(rBO)。rBN有強烈殺滅哈維氏弧菌的作用，對從患病海水養(yǎng)殖魚類中分離到的溶藻弧菌和副溶血

5、弧菌也能有效殺滅。
　　 制備了針對rBN的兔抗血清，免疫組化研究顯示，Pc-BPI的表達在腎組織中的陽性反應較弱，而脾和頭腎組織中陽性反應強烈，且主要在各組織細胞的實質(zhì)性細胞和脾臟血竇的內(nèi)皮細胞及腎小管的上皮細胞的細胞質(zhì)中進行表達，在實質(zhì)性細胞的細胞核中也有輕度的表達。3大黃魚重要的生理功能分子——轉(zhuǎn)錄因子Pc-DP1的生物學特征和功能研究
　　 克隆和表達了大黃魚重要的生理功能分子——轉(zhuǎn)錄因子Pc-DP1(GenBa

6、nk序列號：DQ821446)。其cDNA全長1427 bp,具有一個1239 bp的讀碼框，編碼412個氨基酸。大黃魚Pc-DP1蛋白是一個結構和功能上都非常保守的蛋白，Pc-DP1的氨基酸序列與斑馬魚的DP1的相似性最高(88％)，與爪蟾、人和鼠的相似度均為78％。Pc-DP1氨基酸序列中包含一個典型的保守DNA結合區(qū)域(113-148)和一個與E2F亞家族蛋白結合為二聚體的區(qū)域(149-209)。大黃魚Pc-DP1蛋白的N端多為堿