離子束介導玉米DNA的水稻變異后代生物學效應(yīng)與AFLP分析.pdf

1、離子束介導玉米DNA片段轉(zhuǎn)化水稻經(jīng)5年的培育篩選，已經(jīng)獲得了一批基本穩(wěn)定遺傳的變異株系。本文選用變異群中6個變異株系作為研究對象。首先分析了各變異株系的農(nóng)藝形狀，各變異株系與水稻對照在表型上有較大差異，變異株系的表型差異主要表現(xiàn)為：株型高大，莖桿粗壯，葉鞘為紫色，穎尖顯現(xiàn)紅紫色，高度不育、特早熟、特多分蘗、特矮化株系以及穗型和劍葉直立程度等，有的變異株系具有上述的一種表型變異特征，而有的具有多種表型變異特征。 用SDS-PAGE

2、電泳技術(shù)，在蛋白質(zhì)水平對上述6種變異株系進行差異分析，檢測比較了苗期、孕穗期和抽穗期各變異株系和對照間蛋白差異表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各變異株系和對照間有較大的差異，各變異株系中的蛋白帶有的增多，如苗期中在變異株系A(chǔ)、B、C、D和E中均檢測到新增的41kD蛋白，在抽穗期變異株系A(chǔ)、D檢測到新增帶38kD。有的蛋白帶減少，如在孕穗期變異株系C、D和F的均少檢測到一條23kD蛋白帶，在抽穗期變異株系A(chǔ)、B和F均少檢測到56kD蛋白帶。又用復性電泳技術(shù)

3、分析比較了各變異株系和對照在幾個主要生育期的蛋白水解酶和POD的差異表達情況，檢測pH4.5、pH7.0和pH8.5時各時期蛋白水解酶酶譜變化，發(fā)現(xiàn)變異株系和對照在各時期不同pH條件下酶種類和酶活性均差異顯著，在變異株系中檢測到玉米中的幾條“目的酶帶”，如在孕穗期pH4.5條件下，變異株系A(chǔ)、B、D中均檢到44kD和56kD強帶，而對照CK2中未檢到，在抽穗期pH7.0條件下玉米對照CK1中檢到44kD強酶帶區(qū)，在變異株系A(chǔ)、B、D中也

4、檢到，水稻對照CK2中未檢測到。等變異株系中還檢測到對照中未檢到的一些新酶帶，如變異株系B在孕穗，抽穗期檢測到一條210kD酶帶。在水稻苗期、三葉期、分蘗期、孕穗期、抽穗期葉片中的POD檢測結(jié)果表現(xiàn)為：變異株系和對照水稻間的POD酶譜差異較大，有POD酶帶的缺失和新增，如苗期變異株系A(chǔ)中少檢測到34kD酶帶，變異株系D中少檢測到30kD酶帶，三葉期變異株系A(chǔ)和D多檢測到21和65kD酶帶，變異株系B多檢測到34和38kD酶帶。還有酶活增

5、強和減弱的變化，如苗期變異株系A(chǔ)中的24和30kD酶活比對照CK2增強，21kD酶活比對照減弱，三葉期變異株系B中的25kD酶活比對照增強。并且也檢測到了玉米中的幾條“目的酶帶”，如分蘗期在變異株系A(chǔ)、B、C、D和F中檢測到的26kD弱帶在玉米對照CK1中檢測到在水稻對照CK2中未檢測到。這些在蛋白水平上檢測到的差異條帶說明經(jīng)低能離子束介導轉(zhuǎn)基因處理的變異株系可能使其基因組發(fā)生了某些改變。而這些新增或缺失的酶帶可能跟相關(guān)的變異性狀有緊密

6、的聯(lián)系，對該類酶帶的深入研究可能對揭示相關(guān)的變異性狀分子機理有一定的理論價值。 用AFLP分子標記技術(shù)對變異材料進行多態(tài)分析，首先篩選了64對選擴引物，并統(tǒng)計分析64對選擴引物在4個樣品材料中的擴增情況，優(yōu)選出下列18對引物對：P1M3、P2M3、P2M5、P2M7、P2M8、P3M7、P4M3、P4M4、P5M3、P6M1、P6M2、P6M5、P6M7、P8M2、P8M3、P8M5、P8M6和P8M8。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)對照水稻和玉米雖

7、屬于不同的屬，但二者的圖譜仍有28.86％相似率，而2個變異株系和玉米的圖譜相似率分別達到36.13％和32.57％，變異株系和玉米間的相似性增加，原因可能是外源的玉米DNA整合到水稻核基因組引起的，但有待進一步研究證實。另外發(fā)現(xiàn)變異株系和對照在DNA水平上存在較大的差異，說明了水稻經(jīng)低能離子束介導轉(zhuǎn)基因處理后其基因組內(nèi)部發(fā)生了改變，但其發(fā)生的機理較復雜，仍不清楚。 用優(yōu)選出的引物對6個特殊的變異材料進行AFLP分析，克隆、測序

8、并分析了“目的片段”，對目的片段序列做相似性分析發(fā)現(xiàn)目的片段間的相似性較低，在對差異片段序列的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)這些片段大多數(shù)能在數(shù)據(jù)庫中搜索到100％匹配率的序列，匹配的序列有的信息較清楚，但相關(guān)的基因功能不清，有些匹配的序列存在某些堿基位點的差異，存在單核苷酸多態(tài)性。 對特早熟變異株系A(chǔ)FLP和差異片段序列分析，克隆測序的幾個差異片段在數(shù)據(jù)庫中均未檢測到完全匹配的序列。部分序列僅檢測到覆蓋率70％，匹配相似率100％，匹配區(qū)