嗜線蟲政病桿菌HB310菌株幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其可濕性粉劑的研制.pdf

1、嗜線蟲致病桿菌Xenorhabdus nematophila HB310(Xn HB310)是與小卷蛾斯氏線蟲（Steinernema carpocapsae）共生的細菌，屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae），革蘭氏染色陰性。前期研究發(fā)現(xiàn)Xn HB310具有廣譜的殺蟲和抑菌活性，對其胞內(nèi)總蛋白的質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)含有幾丁質(zhì)酶。本研究從Xn HB310中克隆了2個幾丁質(zhì)酶基因chi60和chi70，為進一步明確共生菌的致病和抑菌

2、機理提供依據(jù)。另外對XnHB310可濕性粉劑配方進行了篩選，得到了50％ Xn HB310可濕性粉劑配方。現(xiàn)將主要結(jié)果總結(jié)如下:
　　 1、對嗜線蟲致病桿菌HB310抑菌活性的測定結(jié)果表明，Xn HB310發(fā)酵液和胞內(nèi)蛋白對蘋果輪紋病菌和蘋果腐爛病菌菌絲生長均有抑制作用。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明Xn HB310胞內(nèi)蛋白含有幾丁質(zhì)酶，初步判斷其抑菌活性可能與幾丁質(zhì)酶有關(guān)。
　　 2、根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果和已報道的X nematophi

3、la ATCC19061菌株中幾丁質(zhì)酶基因設(shè)計了兩對引物，以Xn HB310總DNA為模板，通過PCR擴增的方法分別克隆了兩個編碼幾丁質(zhì)酶的基因chi60和chi70，GenBank登陸號分別為:KC701470和KC701471。對其進一步序列分析顯示，chi60全長基因含有1608個堿基，編碼535個氨基酸組成的蛋白;chi70全長基因含有1947個堿基，編碼648個氨基酸組成的蛋白。然后對chi60和chi70兩個基因進行原核表達

4、，IPTG進行誘導(dǎo)結(jié)果表明這兩個基因沒能在大腸桿菌中成功表達。
　　 3、運用生物信息學(xué)方法對兩個幾丁質(zhì)酶進行了分析，獲得CHI60蛋白理論分子量為59.3kDa，等電點為4.51，CHI60蛋白序列中不含信號肽，屬于穩(wěn)定的水溶性蛋白;CHI70蛋白理論分子量為72.4 kDa，等電點為4.89，CHI70蛋白序列中也不含信號肽，同樣屬于穩(wěn)定的水溶性蛋白。并且采用4種不同的預(yù)測方法分析了CHI60和CHI70蛋白的二級結(jié)構(gòu)，通過

5、同源建模構(gòu)建了精確度較高的CHI60和CHI70蛋白的三級結(jié)構(gòu)。對這兩個蛋白進行了多序列比對，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶有一定的保守區(qū)域。最后構(gòu)建了兩個蛋白的系統(tǒng)進化樹，顯示出幾丁質(zhì)酶蛋白序列具有在細菌分類學(xué)和系統(tǒng)進化學(xué)應(yīng)用的潛在應(yīng)用價值。
　　 4、以Xn HB310細胞沉淀菌粉為原藥，通過對載體、潤濕劑、分散劑的篩選，獲得了50％ Xn HB310可濕性粉劑。其配方為:Xn HB310菌粉50％、分散劑木質(zhì)素磺酸鈉5％、潤濕劑拉開粉5％、