嗜線蟲(chóng)政病桿菌HB310菌株幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其可濕性粉劑的研制.pdf

1、嗜線蟲(chóng)致病桿菌Xenorhabdus nematophila HB310(Xn HB310)是與小卷蛾斯氏線蟲(chóng)（Steinernema carpocapsae）共生的細(xì)菌，屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae），革蘭氏染色陰性。前期研究發(fā)現(xiàn)Xn HB310具有廣譜的殺蟲(chóng)和抑菌活性，對(duì)其胞內(nèi)總蛋白的質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)含有幾丁質(zhì)酶。本研究從Xn HB310中克隆了2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因chi60和chi70，為進(jìn)一步明確共生菌的致病和抑菌

2、機(jī)理提供依據(jù)。另外對(duì)XnHB310可濕性粉劑配方進(jìn)行了篩選，得到了50％ Xn HB310可濕性粉劑配方。現(xiàn)將主要結(jié)果總結(jié)如下:
　　 1、對(duì)嗜線蟲(chóng)致病桿菌HB310抑菌活性的測(cè)定結(jié)果表明，Xn HB310發(fā)酵液和胞內(nèi)蛋白對(duì)蘋果輪紋病菌和蘋果腐爛病菌菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明Xn HB310胞內(nèi)蛋白含有幾丁質(zhì)酶，初步判斷其抑菌活性可能與幾丁質(zhì)酶有關(guān)。
　　 2、根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果和已報(bào)道的X nematophi

3、la ATCC19061菌株中幾丁質(zhì)酶基因設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，以Xn HB310總DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法分別克隆了兩個(gè)編碼幾丁質(zhì)酶的基因chi60和chi70，GenBank登陸號(hào)分別為:KC701470和KC701471。對(duì)其進(jìn)一步序列分析顯示，chi60全長(zhǎng)基因含有1608個(gè)堿基，編碼535個(gè)氨基酸組成的蛋白;chi70全長(zhǎng)基因含有1947個(gè)堿基，編碼648個(gè)氨基酸組成的蛋白。然后對(duì)chi60和chi70兩個(gè)基因進(jìn)行原核表達(dá)

4、，IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)結(jié)果表明這兩個(gè)基因沒(méi)能在大腸桿菌中成功表達(dá)。
　　 3、運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)兩個(gè)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行了分析，獲得CHI60蛋白理論分子量為59.3kDa，等電點(diǎn)為4.51，CHI60蛋白序列中不含信號(hào)肽，屬于穩(wěn)定的水溶性蛋白;CHI70蛋白理論分子量為72.4 kDa，等電點(diǎn)為4.89，CHI70蛋白序列中也不含信號(hào)肽，同樣屬于穩(wěn)定的水溶性蛋白。并且采用4種不同的預(yù)測(cè)方法分析了CHI60和CHI70蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)

5、同源建模構(gòu)建了精確度較高的CHI60和CHI70蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)這兩個(gè)蛋白進(jìn)行了多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶有一定的保守區(qū)域。最后構(gòu)建了兩個(gè)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，顯示出幾丁質(zhì)酶蛋白序列具有在細(xì)菌分類學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)應(yīng)用的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　 4、以Xn HB310細(xì)胞沉淀菌粉為原藥，通過(guò)對(duì)載體、潤(rùn)濕劑、分散劑的篩選，獲得了50％ Xn HB310可濕性粉劑。其配方為:Xn HB310菌粉50％、分散劑木質(zhì)素磺酸鈉5％、潤(rùn)濕劑拉開(kāi)粉5％、