硝酸銀誘導(dǎo)的全雌系苦瓜花性別分化研究.pdf

1、苦瓜(Momordica charantia L.)為葫蘆科苦瓜屬一年生蔓性草本植物，起源于東南亞。苦瓜作為藥食兼用的保健蔬菜，在我國南方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民生活中占有重要地位?？喙蠈佼惢ㄊ诜圩魑铮哂忻黠@的雜種優(yōu)勢。雜交制種時(shí)需綁花做標(biāo)記和套袋隔離，工作量大而繁瑣，在一定程度上制約了苦瓜雜種優(yōu)勢的利用。以全雌系苦瓜為母本雜交制種雖然具有操作簡便和降低成本等優(yōu)點(diǎn)，但是存在由于全雌系苦瓜本身不開雄花導(dǎo)致的自身繁殖困難問題。為了最大限度地提高Ag

2、NO3誘導(dǎo)的全雌系苦瓜自繁率和研究AgNO3誘導(dǎo)花性別分化過程的激素變化和差異基因表達(dá)，本文以全雌系苦瓜‘X—黑—d—d’為試材，從形態(tài)、生理和分子水平分析該過程，取得如下結(jié)果：
　　 1.為了最大限度地提高全雌系苦瓜繁殖率，本研究采用不同濃度的AgNO3和不同處理次數(shù)對不同發(fā)育階段的全雌系苦瓜幼苗進(jìn)行了化學(xué)誘雄試驗(yàn)。結(jié)果表明，在三葉一心到四葉一心期用300 mg/L AgNO3處理2次能成功誘導(dǎo)令雌系苦瓜從第1朵花開始連續(xù)性轉(zhuǎn)

3、化為花粉有活力的兩性花，兩性花平均為11.83朵/株，雄化時(shí)間7.6～8.6天，之后恢復(fù)為全雌花；而且三葉一心期是AgNO3誘導(dǎo)苦瓜雄化的關(guān)鍵時(shí)期。
　　 2.利用cDNA—AFLP技術(shù)研究AgNO3誘導(dǎo)全雌系苦瓜兩性花分化過程差異基因表達(dá)的結(jié)果表明，36對引物組合共獲得84個(gè)AgNO3處理后增強(qiáng)和特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本片段(transcript—derived fragments，TDF)，約占總條帶數(shù)的2.2％。其中20個(gè)經(jīng)反向N

4、orthern雜交驗(yàn)證，18個(gè)TDF為陽性。經(jīng)克隆、測序和在線比對，8個(gè)陽性TDF的核苷酸序列在GenBank中與已知功能基因有較高同源性，功能涉及調(diào)節(jié)激素平衡、RNA加工修飾、基因表達(dá)調(diào)控和能量代謝等；2個(gè)陽性TDF核苷酸序列與功能未知蛋白有同源性序列；7個(gè)陽性TDF與已知表達(dá)序列標(biāo)簽有同源序列，但功能未知：1個(gè)陽性TDF無任何同源序列，預(yù)測是功能未知基因。這些結(jié)果表明AgNO3誘導(dǎo)表達(dá)的這些陽性TDF參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控和能

5、量代謝等性別分化過程。
　　 3.為研究AgNO3誘導(dǎo)的全雌系苦瓜兩性花分化與幼葉和花蕾中內(nèi)源激素的關(guān)系，本研究采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)(enzyme—linked immunosorbent assays，ELISA)測定三葉一心期苦瓜噴施蒸餾水和.AgNO3后72h內(nèi)花蕾和新生葉片中內(nèi)源激素含量。結(jié)果顯示，噴施AgNO3后幼葉中IAA、GA3、ZR和ABA含量與噴水的相比，都是先下降后增加。AgNO3處理的花蕾中這4種激素含量在

6、72h內(nèi)沒有一致變化規(guī)律，但變化幅度大于幼葉的，表明生殖器官的內(nèi)源激素對苦瓜性別分化影響比營養(yǎng)器官的大。AgNO3處理后花蕾中單一激素含量表現(xiàn)出動態(tài)平衡。AgNO3處理后24～48h內(nèi)，花蕾中這4種激素含量明顯低于噴水的，而其余時(shí)間則高于噴水的，此外，AgNO3處理的花蕾中ABA/IAA、ZR/IAA和GA3/IAA比值也在24～48h發(fā)生劇烈的變化，48h之后這些激素比值與噴水的相差不大，表明AgNO3處理后24～48h是性別分化的關(guān)

7、鍵時(shí)期，IAA可能是AgNO3誘導(dǎo)純雌系苦瓜雄性分化的關(guān)鍵激素。
　　 4.利用RT—PCR(Reverse transcription PCR)和RACE(Rapid—amplification of cDNAends)技術(shù)從全雌系苦瓜花蕾中克隆了一個(gè)cDNA全長為1137bp的ACO基因，命名為Mc—AC01(GenBank登錄號：FJ459813)。該基因包含1005 bp的完整開放閱讀框、45 bp5’端非翻譯區(qū)和Pol

8、y(A)在內(nèi)的87 bp3’端非翻譯區(qū)。完整開放閱讀框推測編碼334個(gè)氨基酸的蛋白，分子量(MW)為37.30 kDa，等電點(diǎn)(pI)為6.02。BLAST結(jié)果表明，苦瓜Mc—AC01在核苷酸與氨基酸水平上分別和GenBank中其他物種ACO基因同源性達(dá)73％～80％和77％～85％，說明植物.ACO基因在系統(tǒng)進(jìn)化上相對保守。多序列比較結(jié)果表明，Mc—AC01功能區(qū)域的氨基酸序列較為保守，N—端區(qū)域的差異很大，C—端區(qū)域的差異較小；Mc

9、—AC01含有已報(bào)道植物ACC氧化酶基因的6個(gè)保守區(qū)和7個(gè)二價(jià)鐵離子/抗壞血酸依賴型雙加氧酶家族成員中保守存在的氨基酸殘基，缺失1個(gè)保守區(qū)和2個(gè)保守的二價(jià)鐵離子/抗壞血酸依賴型雙加氧酶家族成員中氨基酸殘基。Mc—AC01在系統(tǒng)進(jìn)化上與雌性系黃瓜雌性分化相關(guān)的Cs—AC03基因聚為一大類，表明Mc—AC01可能是苦瓜雌性分化相關(guān)的ACO基因家族一個(gè)成員。這為進(jìn)一步研究AgNO3誘導(dǎo)全雌系苦瓜兩性花分化與ACC氧化酶基因表達(dá)之間關(guān)系提供了基

10、礎(chǔ)。
　　 5.利用RT—PCR技術(shù)從全雌系苦瓜幼苗花蕾中克隆了一個(gè)cDNA全長為1604 bp的ACS基因，命名為Mc-ACS4(GenBank登錄號：FJ459814)。該序列包含1455 bp的完整開放閱讀框、30 bp5’端非翻譯區(qū)和119 bp3’端非翻譯區(qū)。完整開放閱讀框推測編碼484個(gè)氨基酸的蛋白，分子量(MW)為54.02 kDa，等電點(diǎn)(pI)為6.23。BLAST結(jié)果表明，苦瓜.Mc—ACS4在核苷酸與氨基酸

11、水平上分別和GenBank中植物ACS基因同源性達(dá)73％～99％和64％～99％，說明植物ACS基因在系統(tǒng)進(jìn)化上相對保守。苦瓜Mc—ACS4與苦瓜Mc—ACS3基因僅存在2個(gè)氨基酸差異，同源性高達(dá)99％。多序列比較結(jié)果表明，Mc—ACS4功能區(qū)域的氨基酸序列保守度高，N—端區(qū)域的差異較小，C—端區(qū)域的差異很大；Mc—ACS4含有已報(bào)道的ACC合成酶基因有7個(gè)保守區(qū)和11個(gè)保守氨基酸殘基。Mc—ACS4在系統(tǒng)進(jìn)化上與乙烯誘導(dǎo)冬瓜表達(dá)的AC