多胺對(duì)小菜蛾嗅覺(jué)影響機(jī)制的研究.pdf

1、昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)在昆蟲(chóng)尋找配偶和食物、搜尋產(chǎn)卵場(chǎng)所、躲避外界不利環(huán)境的傷害等起著非常重要的作用。多胺是生物體內(nèi)普遍存在的具有生物活性的一類(lèi)低分子量含氮堿類(lèi)，是精氨酸（Arg）代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)低分子胺，主要有腐胺、亞精胺和精胺。研究表明多胺能夠參與昆蟲(chóng)行為的調(diào)節(jié)過(guò)程。本課題以小菜蛾P(guān)lutella xylostella為研究對(duì)象，對(duì)其嗅覺(jué)相關(guān)蛋白以及多胺對(duì)小菜蛾嗅覺(jué)相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下：
　　 1、小菜蛾嗅

2、覺(jué)相關(guān)蛋白基因的克隆和序列分析
　　 利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆到小菜蛾2個(gè)普通氣味結(jié)合蛋白（GOBP）基因PxylGOBP1（GenBank登錄號(hào)：ABY71034）和PxylGOBP2（GenBank登錄號(hào)：ABY71035），其核苷酸序列全長(zhǎng)分別為504 bp和483 bp，編碼168和163個(gè)氨基酸殘基，這兩個(gè)基因編碼氨基酸序列和其它鱗翅目昆蟲(chóng)GOBP的氨基酸序列比對(duì)同源性較高（70％～80％），但是PxylGO

3、BP1和PxylGOBP2的同源性只有50％，說(shuō)明它們屬于不同的GOBP類(lèi)群；1個(gè)信息素結(jié)合蛋白（PBP）基因PxylPBP1（GenBank登錄號(hào)：FJ201994），其核苷酸序列全長(zhǎng)為504bp，編碼164個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)基因編碼氨基酸序列和其它鱗翅目昆蟲(chóng)PBPs比對(duì)同源性較高（70％～80％）；1個(gè)化學(xué)感受蛋白（CSP）基因PxlyCSP1（GenBank登錄號(hào)：FJ361903），其核苷酸序列全長(zhǎng)405 bp，編碼134個(gè)氨基

4、酸殘基，該基因編碼氨基酸序列和其它鱗翅目昆蟲(chóng)CSP的氨基酸序列比對(duì)同源性較高（70％～80％）。
　　 2、小菜蛾嗅覺(jué)相關(guān)基因的組織和時(shí)空表達(dá)
　　 RT-PCR結(jié)果表明，小菜蛾P(guān)xylGOBP1、PxylGOBP2和PxylPBP1在雌雄觸角中均有表達(dá)，在其他組織中（去觸角頭、足、腹部和翅）均沒(méi)有表達(dá)，而小菜蛾P(guān)xylCSP1不僅在雌雄觸角中表達(dá)，在其他組織（去觸角頭、足、腹部和翅）中也有表達(dá)。Real-timePCR

5、研究表明PxylGOBP1、PxylGOBP2、PxylPBP1和PxylCSP1的表達(dá)水平因被測(cè)小菜蛾的雌雄、日齡、組織不同和交配與否而異，這些基因在卵、幼蟲(chóng)不同齡期和蛹期的表達(dá)量?jī)H為0.01％左右；在卵、幼蟲(chóng)和蛹期，PxylGOBP1的表達(dá)量均比PxylGOBP2高出3倍左右，而在成蟲(chóng)期PxylGOBP1的表達(dá)量?jī)H是PxylGOBP2的1/5，PxylGOBPs在1齡幼蟲(chóng)時(shí)的表達(dá)量在整個(gè)幼蟲(chóng)期最高，可能是和其一孵化出來(lái)就尋找寄主有關(guān)

6、；PxylPBP1的表達(dá)量在小菜蛾卵和蛹期相對(duì)幼蟲(chóng)期較高，隨著齡期的增長(zhǎng)表達(dá)量降低，到3齡幼蟲(chóng)達(dá)到最低值后表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，在成蟲(chóng)期各時(shí)段雄蛾觸角中PxylPBP1的表達(dá)量均比雌蛾高，是雌蛾的3-30倍，在雌雄蛾交配后，PxylPBP1的表達(dá)量均比交配前高；PxylCSP1的表達(dá)量在小菜蛾卵期和蛹期表達(dá)量較幼蟲(chóng)期明顯低，其僅為其的1/10左右，4齡幼蟲(chóng)表達(dá)量在整個(gè)幼蟲(chóng)期表達(dá)量最高，這些可能和小菜蛾幼蟲(chóng)取食有關(guān)，成蟲(chóng)期在羽化4-8h小菜蛾

7、PxylCSP1表達(dá)量較高，交配后雄蟲(chóng)PxylCSP1的表達(dá)量明顯比交配前（羽化16 h）低，而雌蟲(chóng)卻明顯比交配前（羽化16 h）高。綜上所述，小菜蛾嗅覺(jué)相關(guān)基因的表達(dá)和小菜蛾的雌雄、發(fā)育狀態(tài)和交配與否密切相關(guān)，這些是否和小菜蛾可塑性行為相關(guān)還有待我們進(jìn)一步研究。
　　 3、多胺對(duì)小菜蛾嗅覺(jué)相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 腐胺處理后增高了未交配小菜蛾P(guān)xylGOBP1的表達(dá)，但卻明顯抑制了交配小菜蛾P(guān)xylGOBP1的表達(dá)；腐

8、胺處理后明顯抑制了小菜蛾P(guān)xylGOBP2的表達(dá)，僅對(duì)羽化初期（0、4h）的雌蛾觸角中PxylGOBP2的表達(dá)具有增強(qiáng)作用；明顯增強(qiáng)了交配雄蛾P(guān)xylPBP1的表達(dá)，但卻明顯減弱了交配雌蛾P(guān)xylPBP1的表達(dá)；經(jīng)腐胺處理后，雌雄小菜蛾不同時(shí)段PxylCSP1的表達(dá)量明顯降低，只有羽化16h時(shí)表達(dá)量升高。
　　 亞精胺處理后明顯抑制了小菜蛾P(guān)xylGOBP1的表達(dá)，但在羽化4h時(shí)雌雄蛾和交配后雌蛾P(guān)xylGOBP1的表達(dá)量和對(duì)照

9、丙酮處理比明顯增高；亞精胺處理后明顯抑制了小菜蛾P(guān)xylGOBP2的表達(dá)，但卻促進(jìn)了羽化初期（0、4h）小菜蛾雌蛾P(guān)xylGOBP2的表達(dá)；經(jīng)亞精胺處理后小菜蛾雌雄蛾羽化不同時(shí)間觸角中PxylPBP1的表達(dá)均明顯受到抑制；亞精胺處理后明顯抑制了小菜蛾P(guān)xylCSP1的表達(dá)，但在羽化4h時(shí)雄蛾和交配后雌蛾P(guān)xylCSP1的表達(dá)量和對(duì)照丙酮處理比明顯增高。
　　 經(jīng)精胺和DFMO處理后，小菜蛾P(guān)xylGOBP1、PxylGOBP2和

10、PxylCSP1表達(dá)被明顯抑制在一個(gè)很低的水平（和對(duì)照丙酮處理相比）；經(jīng)精胺處理后，對(duì)小菜蛾雄蛾觸角中PxylPBP1的表達(dá)具有促進(jìn)作用，但抑制了交配后雌雄蛾觸角中PxylPBP1的表達(dá)；經(jīng)DFMO處理后對(duì)雌雄蛾不同時(shí)期觸角中PxylPBP1的表達(dá)均具有抑制作用，但對(duì)羽化4h和16h雌蛾觸角中PxylPBP1的表達(dá)具有增強(qiáng)作用。
　　 綜上所述，多胺能調(diào)節(jié)小菜蛾觸角中嗅覺(jué)相關(guān)基因的表達(dá)，這種調(diào)節(jié)能力因處理、雌雄、羽化時(shí)間和交配與

11、否有關(guān)。
　　 4、小菜蛾嗅覺(jué)相關(guān)蛋白基因的原核表達(dá)及蛋白純化
　　 在成功克隆小菜蛾P(guān)xylGOBP1、PxylGOBP2、PxylPBP1和PxylCSP1基因的基礎(chǔ)上，利用基因重組的方法將這4個(gè)基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-22b（+）中，在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，所表達(dá)的4個(gè)重組蛋白大小約為19kD、22kD、18kD和14kD左右，主要以包涵體形式存在。超聲波破碎離

12、心后，用8mol/L尿素對(duì)包涵體進(jìn)行溶解，經(jīng)DE52陰離子親和層析柱一步法純化得到高純度重組蛋白，并且回收率也很高。
　　 5、小菜蛾嗅覺(jué)感器的掃描電鏡觀察
　　 利用掃描電鏡對(duì)小菜蛾觸角及其感器進(jìn)行觀察和研究。結(jié)果表明，小菜蛾觸角為絲狀，其上共有12種感器：毛形感器、刺形感器、腔錐形感器、鱗形感器、栓錐形感器、具彎端感器、巨形感器、錐形感器、端毛、鐘形感器、棒形感器、叉形感器。對(duì)各種感器的形態(tài)、分布特點(diǎn)進(jìn)行了描述，根據(jù)