雞Ga1-8cDNA的克隆及在大腸桿菌和乳酸菌的表達(dá).pdf

1、β-防御素屬抗菌肽，因具有廣譜抗微生物和免疫增強(qiáng)作用以及對病原微生物不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。
　　 為探討雞β-防御素在原核表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)機(jī)制及其抗菌活性。本研究以雞β-防御素-8（Gallinacin-8，Gal-8）為研究對象，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，從安徽三黃雞肝臟組織中克隆出Gal-8基因片段，并構(gòu)建pGEM-T Easy-Gal-8克隆載體、pGEX-6P-1-Gal-8大腸桿菌表達(dá)載體和

2、pN28048-Gal-8乳酸菌表達(dá)載體。誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白GST-Gal-8，經(jīng)親和層析純化獲得了Gal-8，并對純化產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行了初步研究。具體內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1．Gal-8 cDNA的克隆。
　　 參考GenBank注冊的雞β-防御素cDNA序列（DQ677639），設(shè)計(jì)三對引物P1/P2、P3/P4和P5/P6，P1/P2擴(kuò)增Gal-8全基因片段，P3/P4和P5/P6擴(kuò)增編碼成熟肽基因。提取三黃雞

3、總RNA用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR），從安徽三黃雞肝臟組織中克隆出目的基因，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，構(gòu)建pGEM-T Easy-Gal-8克隆載體。提取重組克隆質(zhì)粒并測序，經(jīng)GenBankBLAST程序比對顯示：獲得的安徽三黃雞Gal-8基因共201個(gè)堿基同源性達(dá)99％，其中在第111位有一堿基變異；分析Gal-8編碼框分別由20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、5個(gè)氨基酸的原片段、41個(gè)氨基酸的成熟肽

4、組成。以pGEM-T Easy-Gal-8質(zhì)粒為模板，分別用P3/P4和P5/P6為引物PCR擴(kuò)增了Gal-8成熟肽基因片段。
　　 2．Gal-8成熟肽基因在大腸桿菌中的表達(dá)。
　　 用引物P3/P4PCR擴(kuò)增的Gal-8成熟肽基因和pGEX-6P-1載體雙酶切后連接，構(gòu)建pGEX-6P-1-Gal-8表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，融合蛋白用SDS-PAGE鑒定。結(jié)果表明，表達(dá)的GST

5、-Gal-8融合蛋白分子量約為30kD，可存在于上清和沉淀中。表達(dá)重組子在25℃經(jīng)0.5mmoL IPTG誘導(dǎo)4h后可溶性融合蛋白得到最佳表達(dá)。融合蛋白在上清中的表達(dá)量占菌體總蛋白的19.1％，達(dá)到0.2921mg/mL。融合蛋白上清液用谷胱甘肽．瓊脂糖樹脂柱親和層析純化，獲得了雞β-防御素Gal-8成熟肽。單層瓊脂平板擴(kuò)散法檢測表達(dá)產(chǎn)物體外生物活性，表明Gal-8成熟肽對黃色微球菌有一定的抗菌活性。
　　 3．Gal-8成熟肽

6、基因在乳酸菌中的表達(dá)。
　　 用引物P5/P6PCR擴(kuò)增的Gal-8成熟肽基因和pN28048載體雙酶切后連接，構(gòu)建pN28048-Gal-8表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化乳酸菌Lacotcoccus lactis N29000。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)鑒定后用Nisin誘導(dǎo)表達(dá)，用Tricine-SDS-PAGE鑒定。結(jié)果未檢測到目的條帶，有待Western bloting進(jìn)一步鑒定。
　　 以上研究成功從雞組織中克隆了Gal-8基因片段，構(gòu)建了