水稻細(xì)菌性條斑病菌Tn5突變體的表型篩選與突變位點(diǎn)定位.pdf

1、水稻細(xì)菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pathovar oryzicola，Xoc）引起的水稻細(xì)條病對(duì)廣西部分地區(qū)水稻產(chǎn)量造成影響。隨著水稻與Xoc菲律賓代表菌株BLS256相繼測序成功，Xoc—水稻的互作已成為研究病原菌—植物互作的模式之一。廣西菌株GX01的測序也基本完成，如此豐富的靜態(tài)堿基序列信息正等待著我們從中挖掘動(dòng)態(tài)的病原菌生物學(xué)功能。突變體庫是功能基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)座子可移動(dòng)及可體外驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)座的特點(diǎn)被廣

2、泛應(yīng)用于介導(dǎo)插入突變體庫的構(gòu)建，逐漸成為一個(gè)研究黃單胞菌的強(qiáng)大工具。
　　 本研究以廣西菌株Xoc GX01作為建庫出發(fā)菌株，利用EZ-Tn5TM轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的方法構(gòu)建了Tn5插入突變體庫。第一次電轉(zhuǎn)化共保存2965個(gè)單克隆的轉(zhuǎn)化子，并對(duì)這一批轉(zhuǎn)化子的胞外多糖、胞外蛋白酶、游動(dòng)性、生物膜等表型進(jìn)行檢測。目前已完成的2200個(gè)突變體表型篩選中，我們篩選到胞外多糖分泌能力增強(qiáng)的突變體26個(gè)，胞外多糖分泌能

3、力減弱的突變體31個(gè)，胞外蛋白酶活性增強(qiáng)的突變體77個(gè)，胞外蛋白酶活性減弱的突變體16個(gè)，游動(dòng)性增強(qiáng)的突變體61個(gè)，游動(dòng)性減弱的突變體507個(gè)，并發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)生物膜現(xiàn)象的突變體67個(gè)。
　　 為了驗(yàn)證確實(shí)有轉(zhuǎn)座子的插入，我們從突變體庫中隨機(jī)選取了17個(gè)突變體，提取它們的總DNA，用鑒定引物PCR驗(yàn)證，均能擴(kuò)增出568 bp的目的產(chǎn)物，證明這些轉(zhuǎn)化子均有Tn5插入，假陽性率低。并利用質(zhì)粒拯救的方法進(jìn)一步獲取其轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列，與Xoc

4、GX01全基因組進(jìn)行本地序列比對(duì)(BLAST)，相似性百分比在97％以上，側(cè)翼序列的真實(shí)性比較高，是一種相對(duì)高效的定位方法。
　　 同時(shí)，我們從篩庫過程中選取表型變化相對(duì)明顯的突變體BH90和BA87進(jìn)行致病力檢測，它們的致病力均有不同程度的下降，其定位信息分別為XOC2200和XOC2216。為進(jìn)一步研究這兩個(gè)基因的功能，同時(shí)構(gòu)建了XOC2200和XOC2216的缺失突變體及其互補(bǔ)菌株。XOC2200的編碼產(chǎn)物為Transcr

5、iptional regulator，flagellar regulatoryprotein A; XOC2216的編碼產(chǎn)物為flagellar biosynthesis hook protein。其中Tn5插入突變體BH90及XOC2200的缺失突變體胞外多糖及游動(dòng)性顯著提高，互補(bǔ)菌株表型基本能夠恢復(fù)到野生型狀態(tài)，推測XOC2200可能反向調(diào)控胞外多糖的合成及Xoc的游動(dòng)性。Tn5插入突變體BA87及XOC2216的缺失突變體胞外蛋白