精子預(yù)處理和母牛熱應(yīng)激對牛單性生殖胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)是充分利用雌性動物繁殖性能、加快遺傳育種改良、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物和研究胚胎早期發(fā)育機制的重要手段，主要包括體外受精(IVF)、精子卵胞質(zhì)內(nèi)注射(ICSI)、體細胞核移植以及單性生殖，即孤雌和孤雄生殖。單性生殖胚胎僅含有母源或父源遺傳物質(zhì)，已在模式動物中用來研究基因組印記的發(fā)育調(diào)控機制、建立單性生殖胚胎干細胞系和生產(chǎn)基因修飾動物。家畜孤雄生殖胚胎研究起步晚、生產(chǎn)過程復(fù)雜且效率低，已嚴重阻礙其作用的發(fā)揮。家畜精子在卵胞質(zhì)內(nèi)解聚能

2、力較差可能是影響孤雄生殖胚胎發(fā)育的關(guān)鍵原因之一。精子獲能、頂體反應(yīng)和精卵質(zhì)膜融合是自然受精前精子所經(jīng)歷的主要生理變化。因此，精子注射前進行體外獲能、去除頂體和質(zhì)膜的預(yù)處理以模擬這些變化，可能會增強精子解聚能力從而提高牛孤雄生殖胚胎發(fā)育潛能。
　　 夏季高溫危害母牛體內(nèi)卵母細胞發(fā)育，從而降低奶牛繁殖性能，并減弱卵母細胞及其IVF胚胎發(fā)育能力。因此，母牛熱應(yīng)激也可能對單性生殖胚胎發(fā)育造成影響。另外，此前研究多用季節(jié)反映母牛熱應(yīng)激對卵

3、母細胞質(zhì)量的影響，并不能確切、定量地描述環(huán)境熱應(yīng)激對卵母細胞發(fā)育的損害。溫濕指數(shù)(THI)作為衡量熱應(yīng)激程度的環(huán)境指標已用于檢測熱應(yīng)激對奶牛產(chǎn)奶量和受胎率的影響。因此，用卵母細胞供體母牛所處環(huán)境的THI與卵母細胞質(zhì)量和后期發(fā)育聯(lián)系起來，其結(jié)果更具可比性和參照性。據(jù)報道甜菜堿能幫助微生物、植物和家禽抵抗熱應(yīng)激，尚不清楚甜菜堿對哺乳動物及其細胞的影響。為利用甜菜堿降低母牛熱應(yīng)激對卵母細胞質(zhì)量和發(fā)育能力的負面影響，須先在牛體外細胞模型中鑒定其

4、抗熱應(yīng)激功能。圍繞上述問題，本文做了以下四個方面的研究。
　　 1.精子預(yù)處理對牛精子頂體及質(zhì)膜的影響
　　 本研究目標為篩選高效、安全的去除牛精子頂體和質(zhì)膜方法，初步分析其對精子解聚潛力的影響，并探討精子獲能在其中發(fā)揮的作用。首先利用花生凝集素(FITC-PNA)和麥胚凝集素(FITC-WGA)分別標記了牛精子頂體和質(zhì)膜，定量分析了鈣離子載體(CaA23187)、曲通-100(TX-100)和溶血卵磷脂(LL)三種不同

5、頂體和質(zhì)膜去除劑以及去除前是否獲能對精子頂體和質(zhì)膜狀態(tài)的影響。通過細胞死活檢測和吖啶橙染色，評定了頂體和質(zhì)膜處理對精子活力和染色質(zhì)完整性的影響。最后，在未使用卵母細胞的前提下，利用二硫蘇糖醇(DTT)檢測了牛精子獲能和/或項體、質(zhì)膜去除后的解聚潛能。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)TX-100（61.53±2.06％）和LL(51.87±2.53％)組精子的頂體去除率均顯著(P＜0.05)高于對照（25.81±2.99％）和Ca

6、A23187（33.10±4.73％）。LL組精子質(zhì)膜去除率（62.89±1.72％）顯著(P＜0.05)高于對照組(10.38±1.99％)、CaA23187組（30.13±1.72％）和TX-100組（33.00±1.99％）。與體外獲能處理聯(lián)合，能進一步提高(P＜0.05)頂體和質(zhì)膜的移除效率。
　　 (2)去除精子頂體和質(zhì)膜雖導(dǎo)致精子活力從35.7％（對照組）下降至0～21.5％，但不會影響精子染色質(zhì)完整性。
　　

7、 (3)與對照比，TX-100和LL處理組顯著降低了對DTT誘導(dǎo)解聚不敏感的精子所占比例(6.11±1.00％vs.20.30±0.93％，P＜0.05;3.51±0.82％vs.20.30±0.93％，P＜0.05)。若將精子獲能與LL處理相結(jié)合可顯著增加高度解聚精子所占比例（54.60±1.98％vs.15.62±1.61，P＜0.05）。
　　 2.精子獲能聯(lián)合頂體和質(zhì)膜去除對牛孤雄胚胎發(fā)育的影響
　　 本研究目

8、的是以牛精子克隆孤雄(SpC-AG)胚胎為載體，進一步比較和分析精子獲能以及去除頂體和質(zhì)膜的預(yù)處理方法對精子在卵胞質(zhì)內(nèi)的解聚能力、解聚同步性、以及孤雄胚胎發(fā)育潛能的影響。構(gòu)建的SpC-AG胚胎根據(jù)注射前的精子預(yù)處理方法分組，即獲能(CM)、TX-100、LL、獲能后TX-100處理(CM+TX-100)、獲能后LL處理(CM+LL)以及空白對照。首先，利用熒光染色的方法觀察了各組胚胎內(nèi)精子的解聚情況，并比較了各組胚胎的體外發(fā)育能力。其次

9、，取各組中已卵裂但不能發(fā)育至囊胚的胚胎進行細胞核形態(tài)觀察，檢測胚胎內(nèi)核質(zhì)發(fā)育的同步性。最后，將實驗中得到的桑葚胚和囊胚移植入代孕母牛，以觀察其植入后發(fā)育能力。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)LL預(yù)處理精子顯著提高了構(gòu)建的SpC-AG胚胎內(nèi)兩個精子同步解聚率(51.1％vs.23.3％，P＜0.05)。注射兩個CM+LL精子具有最高的精子同步解聚率(72.2％)和原核形成率(46.3％)。這表明精子注射前去除項體和質(zhì)膜可增強其在S

10、pC-AG胚胎的解聚能力，而獲能可能對精子在卵胞質(zhì)內(nèi)的染色質(zhì)重構(gòu)有促進作用。
　　 (2)首次得到發(fā)育至囊胚期的牛精子克隆孤雄胚胎。TX-100或LL去除頂體和質(zhì)膜能顯著(P＜0.05)降低注射后胞質(zhì)碎裂發(fā)生頻率。LL組SpC-AG胚胎的8-細胞發(fā)育率、桑葚胚和囊胚發(fā)育率均顯著(P＜0.05)高于對照組。CM、CM+TX-100和CM+LL處理都能顯著(P＜0.05)提高SpC-AG囊胚生產(chǎn)效率。
　　 (3)LL處理精

11、子顯著提高了卵裂的SpC-AG胚胎內(nèi)核質(zhì)同步發(fā)育能力（64.1％vs.19.7％，P＜0.001），同時卵裂球內(nèi)精子未解聚的情況顯著減少(10.9％vs.47.5％,P＜0.001)。
　　 (4)SpC-AG胚胎移植后沒有觀察到母牛發(fā)生妊娠，但代孕母牛返情期被延長，暗示胚胎可能在妊娠早期丟失。
　　 3.母牛熱應(yīng)激對牛單性生殖胚胎發(fā)育的影響
　　 為檢測母牛熱應(yīng)激對牛單性生殖胚胎發(fā)育是否有影響，本研究以THI為

12、衡量熱應(yīng)激指示信號，并將卵母細胞供體母牛所受熱應(yīng)激分為無熱應(yīng)激(THI＜72)、輕度熱應(yīng)激(72≤THI＜80)和中高度熱應(yīng)激(THI≥80)三個程度，分析了母牛熱應(yīng)激對共計2585枚卵母細胞體外成熟率以及2807枚ICSI、孤雌和孤雄生殖胚胎發(fā)育能力的影響，并探討了母牛熱應(yīng)激與卵母細胞成熟率以及三類胚胎發(fā)育率的相關(guān)性。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)供體母牛體內(nèi)卵泡發(fā)育時的THI對卵母細胞體外成熟率有影響(P＜0.05)，且兩

13、者呈負相關(guān)(r=-0.37)。輕度熱應(yīng)激(72≤THI＜80)對卵母細胞體外成熟率沒有影響，但中高度熱應(yīng)激組(THI≥80)成熟率顯著降低(52.1±2.9％vs63.2±2.3％,P＜0.01)。
　　 (2)供體母牛體內(nèi)卵泡發(fā)育時的THI對后續(xù)生產(chǎn)的ICSI胚胎的卵裂率(P＜0.01)、4-8細胞發(fā)育率(P＜0.001)和≥16細胞發(fā)育率(P＜0.05)有影響，且與后兩者存在負相關(guān)（r=-0.52和-0.40）。中高度熱應(yīng)激

14、(THI≥80)組胚胎各階段發(fā)育率均顯著降低(P＜0.05)。
　　 (3)未檢測到供體母牛體內(nèi)卵泡發(fā)育時的THI對孤雌胚胎卵裂率有影響，但對其4-8細胞發(fā)育率(P＜0.01)和≥16發(fā)育率(P＜0.05)有影響，且均存在負相關(guān)（r=-0.41和-0.45）。THI≥72時，孤雌胚胎4-8細胞發(fā)育率均顯著(P＜0.05)低于THI＜72時的發(fā)育情況。THI≥80時，孤雌胚胎4-8細胞發(fā)育率和≥16細胞發(fā)育率均顯著低于THI＜72

15、。
　　 (4)未檢測到供體母牛體內(nèi)卵泡發(fā)育時的THI對孤雄胚胎發(fā)育能力的影響。
　　 4.甜菜堿的抗熱應(yīng)激生理功能研究
　　 本研究旨在以三維立體培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為體外模型，探究甜菜堿是否能幫助哺乳動物細胞抵抗熱應(yīng)激不良影響。利用實時定量PCR、TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(TUNEL)檢測和3，3'-[1-(苯氨?；?-3，4-四氮唑]-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸鈉(XTT)檢測分別調(diào)查分析了

16、正常和熱應(yīng)激條件下，甜菜堿對奶牛乳腺上皮細胞熱休克蛋白(HSP)表達水平、細胞凋亡和細胞活力的影響，論證了甜菜堿協(xié)助哺乳動物細胞抵抗熱應(yīng)激損傷的生理作用，為將其應(yīng)用于降低母牛熱應(yīng)激的負面影響提供了理論支撐。主要結(jié)果如下:
　　 (1)熱應(yīng)激條件下，甜菜堿維持了細胞基本形態(tài)，顯著降低了細胞凋亡率(P＜0.0001)并提高了細胞活力(P＜0.05)。
　　 (2)熱應(yīng)激條件下，甜菜堿維持了細胞表達HSP70和HSP27的能力

17、。
　　 (3)正常條件下，甜菜堿降低了細胞HSP需要量并加快了細胞增殖率。
　　 本文得出的主要結(jié)論為:獲能與溶血卵磷脂聯(lián)合處理能高效地去除牛精子頂體和質(zhì)膜，并增強了精子在卵胞質(zhì)內(nèi)的解聚能力、提高了牛孤雄生殖胚胎發(fā)育能力;供體母牛卵泡發(fā)生時所處環(huán)境的THI可作為母牛熱應(yīng)激的指示信號，母牛熱應(yīng)激降低了牛ICSI和孤雌生殖胚胎發(fā)育能力;甜菜堿減弱了熱應(yīng)激對奶牛乳腺上皮細胞的細胞凋亡、細胞活力和熱休克蛋白表達能力下降等負面影