甘蔗與斑茅雜交后代GISH體系構(gòu)建及F1染色體組成.pdf

1、甘蔗近緣屬植物斑茅種質(zhì)的開發(fā)利用是甘蔗種質(zhì)創(chuàng)新研究的重心，基因組原位雜交(GISH)是鑒定雜種和分析雜種染色體組成的有力手段。本研究通過對(duì)GISH關(guān)健步驟進(jìn)行優(yōu)化，建立甘蔗與斑茅雜交后代的GISH技術(shù)體系，并分析F1的染色體組成。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 (1)優(yōu)化了制片技術(shù)：對(duì)取材、預(yù)處理和酶解等關(guān)鍵因素進(jìn)行篩選優(yōu)化，以提高染色體標(biāo)本制備的質(zhì)量。其優(yōu)化后的條件為：在避光，變溫和濕潤(rùn)的條件培養(yǎng)的根尖，根尖生長(zhǎng)到1～2

2、cm取材，用對(duì)二氯苯為預(yù)處藥劑處理根尖2～3h，采用果膠酶1.75[％]，纖維素酶3.5[％]混合酶液于37 ℃對(duì)根尖進(jìn)行酶解3～5h；
　　 (2)防脫片技術(shù)：對(duì)制備染色體標(biāo)本的新玻片用重鉻酸的清洗和多聚賴氨酸包被，在雜交前染色體標(biāo)本玻片于37 ℃烘烤過夜，能有效的減少在雜交中的脫片；
　　 (3)探針與封阻制備技術(shù)：探針采用缺口平移的方法，反應(yīng)時(shí)間在1.5～2h可達(dá)200bp～500bp；用沸水打斷約基因組DNA 3

3、0min 可得所需封阻；
　　 (4)雜交與檢測(cè)過程技術(shù)優(yōu)化：胃蛋白酶處理時(shí)間約為10 min，如新制裸露的染色體標(biāo)本建議不處理；雜交液一般每片50μl，探針濃度3 ng/μl。甘蔗與斑茅雜交后代GISH中封阻DNA濃度為探針DAN的20倍可得到特異的雜交信號(hào)；變性采用分別變性，含探針的雜交液90 ℃，10 min立即冷卻，染色體標(biāo)本在70[％]去離子甲酰胺80 ℃，變性2min30s；雜交時(shí)間12～16h；
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