果蔗對梢腐病病原菌Gibberella fujikuroi侵染的分子響應(yīng).pdf

1、果蔗具有很高的營養(yǎng)價值與經(jīng)濟(jì)價值,是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,在南方數(shù)省逐漸形成了具有一定規(guī)模的產(chǎn)業(yè)。在栽培生產(chǎn)以及貯藏的過程中,不同病害對果蔗的產(chǎn)量與品質(zhì)造成了嚴(yán)重危害,給農(nóng)民帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失。我國果蔗種質(zhì)資源十分豐富,其中也蘊藏著具有各種抗病性狀的栽培品種。但是,對于果蔗與不同病原之間互作機(jī)制的探討以及參與相關(guān)病理反應(yīng)蛋白或基因的挖掘,相關(guān)研究詮釋與實際應(yīng)用還很有限。本研究利用差異蛋白組學(xué)、實時螢光定量PCR與生理生化的方法初步探討果

2、蔗與梢腐病病原菌G fujikuroi之間互作的分子機(jī)制,并利用電子克隆與RT-PCR方法分離果蔗參與抗病途徑的信號傳導(dǎo)因子SGT1與RAR1的編碼基因,分析了果蔗SGT1與RAR1的編碼基因理化性質(zhì)、基因拷貝數(shù)與受到G fujikuroi侵染誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄水平。利用這些研究結(jié)果對果蔗與梢腐病病原菌G fujikuroi之間互作的分子機(jī)制進(jìn)行初步的解釋,并為果蔗的抗病育種提供一些物質(zhì)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑴果蔗接種梢腐病

3、病原G.fujikuroi的葉片蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析。利用梢腐病病原菌G fujikuroi接種10個不同地區(qū)的果蔗栽培品種,表現(xiàn)出不同程度的發(fā)病癥狀。果蔗“白鱔”、“肚度”、“豐城紫皮”與“拔地拉”表現(xiàn)的癥狀比較輕;其它地區(qū)果蔗栽培品種“夏茂”、“溫嶺”、“寧德”、“嵊縣”與“歪干擔(dān)”的葉片癥狀表現(xiàn)明顯,病斑狹長,面積大,并出現(xiàn)壞死部位;果蔗“福安”葉片的癥狀表現(xiàn)為中等程度。選擇果蔗福安作差異蛋白組學(xué)分析,分別在0h與48h時提取葉片蛋

4、白,通過蛋白質(zhì)雙相電泳構(gòu)建蛋白質(zhì)圖譜。通過ImageMaster軟件分析,確定24個差異蛋白點,利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)進(jìn)行分析,獲得肽質(zhì)量指紋圖譜,根據(jù)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢及蛋白質(zhì)鑒定。所鑒定的24個蛋白中可以初步分為5類,分別是參與果蔗病理反應(yīng)的相關(guān)蛋白、抗氧化系統(tǒng)的防衛(wèi)相關(guān)蛋白、抗性蛋白、抗氧化系統(tǒng)的防衛(wèi)相關(guān)蛋白、激酶類蛋白與其它蛋白。這些蛋白可能參與了果蔗與梢腐病病原菌Gfujikuroi之間的

5、病理反應(yīng),但是它們在病理反應(yīng)所產(chǎn)生的網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的功能與作用機(jī)理有待進(jìn)一步的探討。
　　 ⑵梢腐病病原G fujikuroi侵染果蔗葉片相關(guān)生理指標(biāo)的研究。為了初步驗證差異表達(dá)蛋白在果蔗與梢腐病病原菌G fujikuroi互作時的表達(dá)情況,從所鑒定的24個蛋白中選擇超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)與幾丁質(zhì)酶(CHIT)以及相關(guān)指標(biāo)過氧化氫酶(CAT)與丙二醛(MDA)進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明,這些指標(biāo)的變化趨勢相似,都

6、是呈“先升后降”的表達(dá)模式。在不同地區(qū)果蔗栽培品種的葉片中,SOD、POD、CAT、與CHIT活性以及MDA含量存在著很大的差異,說明了不同果蔗栽培品種在生理水平上對于梢腐病病原菌G fujikuroi的反應(yīng)是不相同的,并在不同程度上限制了梢腐病病原菌G fujikuroi的進(jìn)一步擴(kuò)展。
　　 ⑶病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)的實時定量RT-PCR分析。在差異蛋白組學(xué)與生理生化的研究基礎(chǔ)上,選取了SOD、POD、CHIT以及在差異蛋白組學(xué)

7、中呈下降表達(dá)的海藻糖-6-磷酸合酶(TPS6P)作為對象,根據(jù)同源基因設(shè)計簡并引物,進(jìn)行qRT-PCR研究分析。qRT-PCR所擴(kuò)增出的片段序列經(jīng)過測序比對,結(jié)果表明所得到基因片段的序列信息是正確的,分別命名為SoSOD、SoCHIT、SoPOD與SoTPS6P,在GeneBank中的登錄號為GU219845～GU219848。SoSOD、SoCHIT與SoPOD在不同果蔗葉片中受到梢腐病病原菌G fujikuroi誘導(dǎo)后總體上呈上調(diào)表

8、達(dá),SoTPS6P先是出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)后再呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。qRT-PCR分析結(jié)果表明梢腐病病原菌引起果蔗病程相關(guān)蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,為其在相應(yīng)的代謝途徑中的調(diào)節(jié)作用提供一些理論依據(jù)。
　　 ⑷果蔗防衛(wèi)相關(guān)基因SoSgtl與SoRarl的克隆與特征分析。根據(jù)已克隆的其他植物的SGT1與RAR1基因的保守序列設(shè)計引物,從果蔗福安葉片中獲得了SGT1與RAR1類似基因片段,利用電子克隆與RT-PCR驗證,得到果蔗SGT1與RAR1的

9、全長基因cDNA序列,分別命名為SoSgtl與SoRarl,在GeneBank中的登錄號為GQ864255與GQ864256。SoSgtl具有1086個堿基的開放閱讀框,編碼362個氨基酸,含有SGT1基因典型的TPR、CS和SGS結(jié)構(gòu)域。SoRarl包含645個堿基的開放閱讀框,編碼215個氨基酸,具有CHORDⅠ、CCCH和CHORDⅡ結(jié)構(gòu)域。與其它植物SGT1和RAR1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比較分析表明,果蔗SoSgtl與SoR

10、arl的氨基酸序列與其它作物之間具有很高的保守性,含有起到關(guān)鍵功能作用的保守區(qū)域。Southern雜交結(jié)果表明,SoSgtl與SoRarl在果蔗中具有1-2個拷貝。利用半定量RT-PCR研究果蔗受G fujikuroi誘導(dǎo)時SoSgtl與SoRarl的表達(dá)情況,結(jié)果表明果蔗SoSgtl與SoRarl的表達(dá)量得到提高,而且不同地區(qū)栽培品種葉片中表達(dá)存在著很大的差異。分別構(gòu)建果蔗SoSgtl與SoRarl的植物反義真核表達(dá)載體,并初步進(jìn)行了